關于免疫功能檢驗方法的研究現狀

李 娜 矯 健 姜素云 竇德強

1.大連市食品藥品檢驗所,遼寧大連 116021; 2.遼寧中醫藥大學，遼寧大連 116000

常常用亢進或低下來描述機體的免疫功能，對于機體來說亢進、低下都是有害的。人的身體健康與否，取決于機體的免疫功能是否能達到免疫功能的相對平衡，即保持相對的自身穩定。該文綜述了目前國內外對免疫藥物功能檢驗的一些方法，以期為免疫藥物的進一步研究和質量控制提供參考。

1 免疫器官功能測定

小鼠稱重，取胸腺、脾臟，稱濕重，計算臟器指數，根據胸腺指數和脾指數是否升高來判定受試物對機體免疫的調節能力[1]。

2 細胞免疫功能測定

2.1 MTT法

1983年Mosmann[2]用MTT顯色反應法檢測細胞增殖細胞中線粒體內酶還原MTT形成蘭紫色的甲臜，甲臜的量與細胞增殖程度呈一定關系，此法簡便、快速、準確但是不夠穩定。1994年，董德平等[3]對MTT比色法的條件進行了探討，發現甲臜溶解劑易引起蛋白沉淀，得出DMSO是一種較為理想的甲臜溶解劑。2000年，趙承彥等[4]對MTT法顯色條件進行了分析，認為MTT反應體系在pH值為6.7，Formazan溶劑是正丙醇、異丙醇和乙二醇乙醚時有很好的靈敏性和穩定性。去掉細胞培養上清，檢測細胞上的酶，用溶劑使蛋白質變性，經沉淀去掉蛋白質影響，能使MTT實驗方法的本底降低，也可以提高靈敏度MTT比色法無需特殊儀器，且操作簡便快速準確，國內外大多采用該法。

2.2 同位素摻入法

同位素摻入法原理是有絲分裂原PHA、ConA等刺激T淋巴細胞產生增殖反應，明顯增加DNA和RNA合成，如將H3-胸腺嘧啶核苷(H3-TdR)加入到培養液中,則可被轉化中的細胞攝入，淋巴細胞增殖的程度可由測定標記淋巴細胞的放射強度反映出[5]。原材料成本高，設備價格高，且易對環境造成污染是此方法的缺點。徐淑云[6]報道了MTT比色法與3H-TdR滲入法兩法比較試驗表明，兩種方法平行相關，MTT比色法具有簡單、快速、敏感的優點。但是MTT方法只能檢測已形成的細胞,而同位素標記法能檢測細胞形成的初期即DNA合成的啟動階段,結果準確[7]。

2.3 遲發型變態反應(DTH)

70年代初期，有學者[8-9]用特異抗原誘導測定腳掌或耳腫脹來表示DTH。后來，Hartley[10]提出了用綿羊紅細胞抗原致敏，然后在尾中部皮下進行攻擊注射，通過測定尾部腫脹程度來表示DTH，該法有較高的重復性和可靠性。現在多數實驗[6]都用1%丙酮麻油致敏，5 d后，測耳腫脹度來表示DTH。DTH實驗方法簡便，但是在實驗過程中，致敏范圍和打孔位置是否一致，對實驗的結果有影響。

3 體液免疫功能測定

3.1 抗體生成細胞檢測

1963年，Jerne[11]首先建立了溶血空斑實驗。1964年，Ingraham和Bussard[12]利用半固體介質將其改良成瓊脂與致甲基纖維素溶血空斑平板法。1965年，Cunningham等[13]利用載玻片制作小室改良成單片玻片小室溶血空斑法。1973年，Sulitzeam和Marbrook[14]發現了瓊脂或瓊脂糖溶血空斑玻片法。1975年，Simpson和Gozzo[15]根據溶血空斑原理將其改良成淋巴介導紅細胞的分光光度法，將免疫脾細胞(對照用正常脾細胞)，SRBC和補體在液相介質中進行反應，觀察紅細胞被抗體生成細胞產生的IgM所裂解，而釋放的血紅蛋白量，用分光光度計作定量測定，據此推知抗據此推知抗體生成細胞多少。1976年，Gronwicz等[16]通過加入針對產生免疫球蛋白細胞供者的Ig的抗體，從而細胞產生的免疫球蛋白結合形成復合物，復合物上的Fc片段可與連接在SRBC上的SPA結合，同時激活補休使SRBC溶解形成空斑即葡萄球菌A蛋白—SRBC溶血空斑法。以上各種方法各有優缺點，實驗者應根據實驗目的選擇合適的方法。

3.2 血清溶血素的測定

血清溶血素的測定有血凝法和半數溶血值2種測定方法。血凝法用SRBC免疫動物后，抗SRBC抗體(溶血素)產生，利用其凝集SRBC的程度來對溶血素的水平進行檢測[5]。1979年，徐學瑛[17]報道了小鼠血清溶血素測定法。1999年，雷林生[18]等將含有溶血素的血清樣品適當預稀釋,然后取100 μL加入96孔板中進行有限的倍比稀釋來測定小鼠血清溶血素的活性。該法準確可靠、重復性好。半數溶血值(HC50)用SRBC免疫動物后，血清中出現SRBC抗體(溶血素)，發生溶血反應，釋放血紅蛋白，通過測定血紅蛋白含量反映血清中溶血素的含量[5]。

4 巨噬細胞功能測定

4.1 小鼠腹腔巨噬細胞吞噬細胞實驗

徐淑云介紹用新鮮雞紅細胞作為吞噬物，半體內法測定小鼠吞噬功能。1989年，陳逐[19]又對其進行了改進，將雞紅細胞進行醛化并省去體內孵育步驟，此法提高了吞噬率和實驗的穩定性。后又有學者[20]在實驗前24h用淀粉刺激巨噬細胞滲出，并于注射臨時配制的雞紅細胞30 min后觀察實驗結果，也取得了良好的效果。但是巨噬細胞吞噬能力經小鼠腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞實驗檢測，需要操者顯微鏡下計數，存在效率低、工作量大、受主觀影響大的缺點。2009年，王輝等[21]又提出了腹腔巨噬細胞吞噬乳膠顆粒的試驗作為一種替代方法,與傳統方法比較可以減少雞紅細胞的使用,該法操作簡單，結果準確。

4.2 流式細胞技術(FCM)

1982年Steinkamp首創熒光微球流式細胞術定量檢測吞噬功能。上世紀80～90年代期間，許多學者[24-26]用流式細胞儀檢測了中性粒細胞的吞噬功能。20年代初期,陳衛國等[27]用綠色熒光蛋白基因轉染方法標記大腸埃希菌,用于觀察PMN吞噬細菌動力學,但該方法操作麻煩又不夠準確。2002年，Gaforio等[28]用SYTOXGreen染料標記大腸埃希菌,用流式細胞儀檢測PMN的吞噬功能，但是價格昂貴。2004年，趙修春[29]等用流式細胞術檢測小鼠PMN吞噬FITC標記大腸埃希菌，該法快速、簡便、重復性好。流式細胞儀方法一次獲取10 000個細胞,相比于鏡下肉眼觀察計數100個細胞,大為提高了檢測樣本的代表性,實驗結果的精度也更為可靠和保證。采用流式細胞術檢測巨噬細胞吞噬功能的方法不僅準確、靈敏,更為重要的是它的高通量的特點使檢驗效率大大提高了,檢驗過程中人為主觀因素的影響減少了[30]。因此,無論是考慮方法的精確度、靈敏度,還是提高檢驗效率等因素,保健食品或相關物質增強免疫力功能的評價采用小鼠腹腔巨噬細胞吞噬熒光微球實驗有很好的應用前景[31]。

5 單核-巨噬細胞功能測定

單核巨噬細胞系統是機體最重要的防御系統,它吞噬某些可溶性異物或異體顆粒的能力強大而迅速,并能將體內自身產生的某些有害物質迅速清除。保健食品檢驗和評價技術規范[5]中給予墨汁途徑為小鼠尾靜脈，但是由于小鼠尾靜脈細小及季節環境對小鼠影響較大，嚴重影響實驗結果。有學者[22-23]認為通過小鼠內眥靜脈注入墨汁，其操作簡單，成功率高。小鼠碳廓清實驗操作容易,初學者可很快掌握,不需特殊條件,易為一般實驗室所接受,為免疫調節劑的體內試驗研究提供了較為穩定而方便的方法。

6 NK細胞活性測定

6.1 同位素釋放法

自90年代以來，國內外大都采用51Cr釋放試驗，該法靈敏度高，操作方便，測定迅速并且能夠定量分析，但51Cr具有半衰期短和放射性等缺點[32]。也有用125I-Udr釋放法，該法自然釋放率低但是需要酶處理且價格貴。目前使用較多的是3H-Tdr釋放法，該法突出的優點是半衰期長，缺點是非特異標記高及污染環境。

6.2 乳酸脫氫酶(LDH)測定法

1983年，KorzeniewskiC[33]報道了LDH釋放法，該法測定迅速準確，自然釋放率低。又有學者[34]在原法的基礎上將它的效靶比、反應時間和表面活性劑加以改進以利于LDH更好的應用。20年代初期，劉家國[35]等提出了幾個影響NK細胞活性的主要因素，認為各實驗室之間統一檢測程序可提高結果的可比性。相比于免疫常用方法51Cr釋放法,LDH測定法具有不存在同位素污染和操作省時等優點,但影響此法的因素較多，實際操作不易掌握[7]。現在國內大多采用乳酸脫氫酶釋放法，但表現出敏感性低的缺點,從而期待發展敏感、特異、安全、簡單、快捷的檢測細胞毒活性方法。

6.3 化學發光法

顧依平[36]報道對NK細胞殺傷腫瘤細胞前后ATP水平(表現為化學發光強度)的動態變化檢測應用了蟲熒光素酶,借以對NK細胞的免疫活性進行檢測。

7 結語

免疫功能檢驗不能用簡單的理化分析與儀器分析的方法進行測定。目前所報道的諸多方法也是各有所長，在實際檢測中應根據情況采用兩種或兩種以上的方法進行，以使研究結果的準確性與可靠得到保證性。隨著人們對免疫藥物的不斷深入研究，檢測藥物對免疫系統的各種代表性指標的改變可對增強免疫力作用的功能做出相應判定。

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