抑郁癥大鼠海馬體積異常的形態學探討

徐愛軍， 劉 昊， 劉 英， 李世英， 張 蕊， 王鳳玲， 王海濤

抑郁癥(depression)是一種情感性精神疾病，臨床表現以情緒低落為主要特征，嚴重時甚至伴隨幻覺妄想和自殺傾向。抑郁癥的嚴重性和危害性越來越受到重視，但其發病機制迄今尚未完全闡明。目前已經證實，抑郁癥患者海馬容積存在明顯萎縮現象［1～4］。探討抑郁癥患者海馬萎縮的原因對于揭示抑郁癥發病機制有重要意義。我們推測在抑郁癥發病過程中，海馬部位神經元異常死亡，造成神經元減少或丟失。為驗證這一假設，本實驗建立抑郁癥大鼠模型，觀察海馬神經元形態改變，檢測神經元凋亡和自噬的發生，為揭示抑郁癥海馬體積異常原因提供實驗依據。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 健康成年雄性SD大鼠40只，體重220～260 g(河北聯合大學實驗動物中心提供，動物合格證編號:SCXK京2009-0004)，適應性飼養7 d后用于實驗。

1.2 試劑藥品與儀器 LC-3兔多克隆抗體、Beclin 1羊多克隆抗體和β-actin鼠單克隆抗體(Santz Cruz，美國);免疫印跡相關試劑(武漢博士德生物工程有限公司);蛋白電泳系統(北京六一);高靈敏度化學發光系統(Bio-RAD，美國)。

1.3 動物分組和模型建立 將大鼠隨機分為對照組(20只)和模型組(20只)。對照組大鼠除每天抓取一次外不做特殊處理。模型組大鼠給予慢性不可預見性溫和應激(CUMS)，建立抑郁模型。應激包括11種:鼠籠45℃傾斜24 h，潮濕墊料24 h，行為限制3 h，4℃冰水游泳5 min，42℃熱水游泳5 min，禁食24 h，禁水 24 h，夾尾 1 min，鼠籠搖動 15 min，持續光照36 h，雙耳電擊5 s(0.8 mA)。將上述11種應激隨即分配到21 d內，每日給予大鼠一種應激，每種應激平均出現2次，同種應激不連續出現。

1.4 大鼠海馬尼氏染色 將兩組大鼠用10%水合氯醛腹腔注射麻醉，4%多聚甲醛PBS緩沖液經心臟灌流固定，分離腦組織，常規石蠟包埋，冠狀切片，片厚5μm。將石蠟切片常規脫蠟至水，尼氏染液室溫染色30 min。用蒸餾水沖洗3次，梯度酒精脫水，二甲苯透明，樹脂封片。光學顯微鏡下觀察。

1.5 流式細胞術檢測海馬神經元凋亡 將兩組大鼠各麻醉后斷頭取腦。根據圖譜，在立體顯微鏡下取右側海馬，制成細胞懸液，細胞濃度為5×105/ml-1×106/ml。取1 ml細胞，1000 r/min 4 ℃離心10 min，棄上清，加入1 ml預冷PBS，輕輕振蕩使細胞懸浮。重復操作3次，棄上清。將細胞重懸于200μl Binding Buffer液中，加入 10μl Annexin VFITC和5μl Propidium Iodide，輕輕混勻，避光室溫反應15 min。加入300μl Binding Buffer液，上機檢測。

1.6 Western blotting檢測海馬LC-3和Beclin-1 將兩組大鼠麻醉后斷頭取腦。根據圖譜，在體視顯微鏡下快速分離海馬，提取組織總蛋白。定量后按照30μg蛋白量上樣，進行12%SDS-PAGE電泳，PVDF膜電轉印，脫脂奶粉封閉，一抗(LC-3，1:400;Beclin-1，1:400)4℃孵育過夜，二抗IgG(1:5000)室溫孵育1 h，ECL顯色。同樣方法進行內參照β-actin的Western blotting分析。以目的條帶與內參照的光密度比值表示目的蛋白的相對表達。

1.7 統計學分析 應用SPSS13.0統計分析軟件對數據進行統計分析，數據均以均值±標準差(χ±s)表示，進行t檢驗，P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 海馬神經元形態改變 尼氏染色顯示對照組大鼠海馬錐體細胞層厚，細胞密度大，排列整齊、緊密，胞體飽滿，突起明顯。模型組大鼠海馬錐體細胞層變薄，細胞間隙大，排列疏松，體積明顯縮小，細胞核萎縮，突起減少(見圖1)。

2.2 流式細胞術檢測結果 模型組和對照海馬神經元組細胞凋亡率分別為17.14±2.71和3.34±0.80，模型組高于對照組(P ＜0.05)。

2.3 海馬組織LC-3和Beclin 1表達 LC-3的表達呈現深淺不同的兩條條帶LC-3Ⅰ和LC-3Ⅱ。對免疫印跡圖像進行定量分析，結果顯示模型組海馬LC-3Ⅱ/LC-3Ⅰ比值和Beclin 1相對表達均高于對照組，差異具有統計學意義(P＜0.05，見表1、圖2)。

表1 兩組大鼠海馬LC-3和Beclin 1表達水平(n=5，χ±s)

圖1 大鼠海馬尼氏染色圖像(200×)。A:對照組;B:模型組

圖2 兩組大鼠海馬LC-3和Beclin 1的表達

3 討論

研究發現［5，6］，抑郁癥患者存在腦形態結構的改變，以海馬和杏仁核等部位尤為明顯。海馬萎縮是抑郁癥的病理特征之一［7］。本實驗采用尼氏染色和透射電子顯微鏡觀察海馬神經元結構改變。結果表明模型組大鼠海馬錐體細胞層變薄，細胞間隙大，排列紊亂、疏松，細胞結構不完整，甚至有細胞缺失，提示抑郁癥大鼠海馬部位存在明顯的神經細胞死亡。細胞的死亡方式有程序性死亡和壞死，前者包括凋亡和自噬。創傷后應激障礙患者同樣存在海馬萎縮現象，其原因可能與海馬部位存在明顯的神經細胞凋亡現象有關［8，9］。

本研究建立應激抑郁模型，采用流式細胞術檢測海馬神經元的凋亡情況。結果表明，與對照組比較，模型組大鼠海馬細胞凋亡率顯著增高。提示慢性應激抑郁大鼠海馬存在明顯的細胞凋亡現象。哺乳動物的自噬相關基因有微管相關蛋白輕鏈-3(LC-3)和Beclin-1。在哺乳動物細胞內，存在兩種形式的LC-3，即LC-3Ⅰ和LC-3Ⅱ。其中，LC-3Ⅰ向LC-3Ⅱ轉化或者LC-3Ⅱ和LC-3Ⅰ的比例增大與自噬泡的形成數量相關，LC3-Ⅱ被認為是自噬體的標志分子［10］。Beclin-1參與自噬體的早期形成過程，是自噬重要的正調節因子。Yu等在成年大鼠大腦皮層、海馬等部位檢測到高表達的Beclin-1，提示這些部位細胞自噬活躍［11］。

本研究結果顯示，抑郁癥模型大鼠海馬自噬標志分子LC-3Ⅱ比例增高，Beclin-1明顯上調。這均提示抑郁癥大鼠海馬神經元存在明顯的細胞自噬。

自噬也被稱為Ⅱ型程序性死亡，是細胞通過單層或雙層膜包裹待降解物形成自噬體，運送到溶酶體形成的自噬溶酶體并進行多種酶的消化和降解，以實現細胞本身的代謝需要和細胞器的更新。自噬對細胞起保護和引發死亡的雙重作用［12］。正常情況下，細胞自噬處在比較低的基礎水平。在輕度應激時，自噬作為促生存機制，被適度激活以保護細胞免于凋亡和壞死;而在嚴重刺激時，自噬被過度激活引起細胞發生程序性死亡，參與多種疾病的發生與發展。本研究結果提示，抑郁癥大鼠海馬神經元存在明顯的凋亡和自噬，這可能是導致海馬縮小的原因。凋亡和自噬二者關系復雜。海馬神經細胞存在明顯的細胞凋亡和自噬，兩者在抑郁癥發病中的關系有待進一步深入研究。

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