基于酶抑制原理的電噴霧質(zhì)譜法快速篩查蔬菜中氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留

羅輝泰　黃曉蘭　吳惠勤　張立　郭寅龍　朱志鑫　黃芳　林曉珊

摘要采用電噴霧質(zhì)譜（ESIMS），通過測定乙酰膽堿酯酶（Acetylcholinesterase， AChE）的抑制率，建立了蔬菜中氨基甲酸酯類農(nóng)藥（Carbamate pesticides， CBPs）殘留的快速篩查方法。樣品經(jīng)QuEChERS方法簡單處理后，以硫代乙酰膽堿為底物，與AChE發(fā)生酶促反應(yīng)，用ESIMS法測定底物轉(zhuǎn)化成產(chǎn)物硫代膽堿的轉(zhuǎn)化率， 進(jìn)而計(jì)算得到AChE的抑制率。本實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了酶促反應(yīng)溫度、時間及濃度等條件，考察了10種常見CBPs農(nóng)藥濃度與AChE抑制率的關(guān)系，研究了實(shí)際蔬菜樣品存在的基質(zhì)效應(yīng)，以不含農(nóng)藥的空白蔬菜樣品的酶抑制率的3倍確立了方法的檢出限。結(jié)果表明，方法檢出限可達(dá)到0.01～0.05 mg/kg，優(yōu)于現(xiàn)行的農(nóng)藥殘留快速篩查國家標(biāo)準(zhǔn)，完全滿足食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)對食品中農(nóng)藥最大殘留限量的要求，且具有良好的抗基質(zhì)干擾能力，可有效避免假陽性結(jié)果的出現(xiàn)，并通過了液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法的驗(yàn)證。本方法簡便快速、靈敏可靠，適用于蔬菜中氨基甲酸酯類農(nóng)藥的快速、高通量篩查。關(guān)鍵詞酶抑制； 電噴霧質(zhì)譜； 蔬菜； 氨基甲酸酯類農(nóng)藥； 快速篩查； 高通量

氨基甲酸酯類農(nóng)藥（CBPs）自問世以來，因其具有選擇性強(qiáng)、殺蟲譜廣等特點(diǎn)＼[1＼]，被廣泛用于防治植物病蟲害，對提高農(nóng)作物產(chǎn)率，促進(jìn)農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)發(fā)展起到非常重要的作用。但近年來，由于氨基甲酸酯類農(nóng)藥的長期使用、濫用或超量使用，導(dǎo)致蔬菜水果等植物源性食品中殘留農(nóng)藥超標(biāo)嚴(yán)重，由此而造成的農(nóng)藥急慢性中毒事件時有發(fā)生。這類農(nóng)藥通過抑制體內(nèi)乙酰膽堿酯酶（AChE）的活性，使其不能分解乙酰膽堿（ACh）而導(dǎo)致組織中乙酰膽堿過量蓄積，引起人體中樞神經(jīng)系統(tǒng)癥狀甚至導(dǎo)致死亡＼[2＼]。為了避免此類中毒事件的發(fā)生和實(shí)現(xiàn)農(nóng)產(chǎn)品中殘留農(nóng)藥的有效監(jiān)測，建立蔬菜水果中快速、靈敏的氨基甲酸酯類農(nóng)藥檢測方法顯得異常迫切。

目前，已有許多分析方法用于氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留的檢測，如生物傳感器[3]、液相色譜法＼[4，5＼]、氣相色譜法＼[6＼]、氣相色譜質(zhì)譜法＼[7＼]及液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法＼[8～10＼]等。由于大多數(shù)CBPs屬于難揮發(fā)化合物，氣相色譜法或氣相色譜質(zhì)譜法只能檢測少數(shù)幾種CBPs； 對于基質(zhì)復(fù)雜的樣品，液相色譜法的靈敏度和可靠性均難以達(dá)到要求； 而最適宜分析CBPs的液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法，其分析時間也較長，且需要提供目標(biāo)農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品做對照，無法實(shí)現(xiàn)快速高通量測試。

氨基甲酸酯類農(nóng)藥的快速檢測方法是基于CBPs對AChE抑制的原理。AChE具有催化乙酰膽堿水解成膽堿的作用，過程如圖1所示，而一旦CBPs與其結(jié)合，將使其失去催化反應(yīng)能力。因而，CBPs的殘留可以通過AChE活性被抑制的情況間接進(jìn)行測定。目前，基于此原理測定農(nóng)殘的方法主要有速測卡法＼[11＼]、分光光度法＼[12，13＼]、pH法＼[13＼] 、酶生物傳感器法＼[14＼]。然而，前3種方法靈敏度過低，且極易受樣品基質(zhì)干擾而出現(xiàn)假陽性結(jié)果； 酶生物傳感器法雖然其靈敏度較高，但步驟多且繁瑣。與現(xiàn)有方法相比，質(zhì)譜儀因具有快速、準(zhǔn)確、靈敏、抗基質(zhì)干擾能力強(qiáng)等多方面優(yōu)勢，已開始用于酶活測定。如Xu等＼[15＼]采用基質(zhì)輔助激光解析離子化傅立葉變換質(zhì)譜（MALDIFTMS），通過測定AChE底物及其產(chǎn)物的含量實(shí)現(xiàn)了酶活的測定，建立了基于此技術(shù)的有機(jī)磷農(nóng)藥篩查方法＼[16～18＼]，這種方法具有快速、高通量、高靈敏度的優(yōu)勢，但由于MALDIFTMS儀器成本高昂，普及率低，方法難以推廣應(yīng)用。另外，目前還未見基于此原理的質(zhì)譜法測定氨基甲酸酯類農(nóng)藥的報道。本實(shí)驗(yàn)采用已較為普及的電噴霧質(zhì)譜（ESIMS），建立基于酶抑制原理的快速篩查蔬菜中氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留的新方法，該法在滿足快速、靈敏、高通量要求的同時，大大降低了篩查成本，便于方法的推廣應(yīng)用。迄今為止，采用ESIMS，通過測定AChE活性，快速篩查CBPs的方法尚未見報道。

摘要采用電噴霧質(zhì)譜（ESIMS），通過測定乙酰膽堿酯酶（Acetylcholinesterase， AChE）的抑制率，建立了蔬菜中氨基甲酸酯類農(nóng)藥（Carbamate pesticides， CBPs）殘留的快速篩查方法。樣品經(jīng)QuEChERS方法簡單處理后，以硫代乙酰膽堿為底物，與AChE發(fā)生酶促反應(yīng)，用ESIMS法測定底物轉(zhuǎn)化成產(chǎn)物硫代膽堿的轉(zhuǎn)化率， 進(jìn)而計(jì)算得到AChE的抑制率。本實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了酶促反應(yīng)溫度、時間及濃度等條件，考察了10種常見CBPs農(nóng)藥濃度與AChE抑制率的關(guān)系，研究了實(shí)際蔬菜樣品存在的基質(zhì)效應(yīng)，以不含農(nóng)藥的空白蔬菜樣品的酶抑制率的3倍確立了方法的檢出限。結(jié)果表明，方法檢出限可達(dá)到0.01～0.05 mg/kg，優(yōu)于現(xiàn)行的農(nóng)藥殘留快速篩查國家標(biāo)準(zhǔn)，完全滿足食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)對食品中農(nóng)藥最大殘留限量的要求，且具有良好的抗基質(zhì)干擾能力，可有效避免假陽性結(jié)果的出現(xiàn)，并通過了液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法的驗(yàn)證。本方法簡便快速、靈敏可靠，適用于蔬菜中氨基甲酸酯類農(nóng)藥的快速、高通量篩查。關(guān)鍵詞酶抑制； 電噴霧質(zhì)譜； 蔬菜； 氨基甲酸酯類農(nóng)藥； 快速篩查； 高通量

氨基甲酸酯類農(nóng)藥（CBPs）自問世以來，因其具有選擇性強(qiáng)、殺蟲譜廣等特點(diǎn)＼[1＼]，被廣泛用于防治植物病蟲害，對提高農(nóng)作物產(chǎn)率，促進(jìn)農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)發(fā)展起到非常重要的作用。但近年來，由于氨基甲酸酯類農(nóng)藥的長期使用、濫用或超量使用，導(dǎo)致蔬菜水果等植物源性食品中殘留農(nóng)藥超標(biāo)嚴(yán)重，由此而造成的農(nóng)藥急慢性中毒事件時有發(fā)生。這類農(nóng)藥通過抑制體內(nèi)乙酰膽堿酯酶（AChE）的活性，使其不能分解乙酰膽堿（ACh）而導(dǎo)致組織中乙酰膽堿過量蓄積，引起人體中樞神經(jīng)系統(tǒng)癥狀甚至導(dǎo)致死亡＼[2＼]。為了避免此類中毒事件的發(fā)生和實(shí)現(xiàn)農(nóng)產(chǎn)品中殘留農(nóng)藥的有效監(jiān)測，建立蔬菜水果中快速、靈敏的氨基甲酸酯類農(nóng)藥檢測方法顯得異常迫切。

目前，已有許多分析方法用于氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留的檢測，如生物傳感器[3]、液相色譜法＼[4，5＼]、氣相色譜法＼[6＼]、氣相色譜質(zhì)譜法＼[7＼]及液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法＼[8～10＼]等。由于大多數(shù)CBPs屬于難揮發(fā)化合物，氣相色譜法或氣相色譜質(zhì)譜法只能檢測少數(shù)幾種CBPs； 對于基質(zhì)復(fù)雜的樣品，液相色譜法的靈敏度和可靠性均難以達(dá)到要求； 而最適宜分析CBPs的液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法，其分析時間也較長，且需要提供目標(biāo)農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品做對照，無法實(shí)現(xiàn)快速高通量測試。

氨基甲酸酯類農(nóng)藥的快速檢測方法是基于CBPs對AChE抑制的原理。AChE具有催化乙酰膽堿水解成膽堿的作用，過程如圖1所示，而一旦CBPs與其結(jié)合，將使其失去催化反應(yīng)能力。因而，CBPs的殘留可以通過AChE活性被抑制的情況間接進(jìn)行測定。目前，基于此原理測定農(nóng)殘的方法主要有速測卡法＼[11＼]、分光光度法＼[12，13＼]、pH法＼[13＼] 、酶生物傳感器法＼[14＼]。然而，前3種方法靈敏度過低，且極易受樣品基質(zhì)干擾而出現(xiàn)假陽性結(jié)果； 酶生物傳感器法雖然其靈敏度較高，但步驟多且繁瑣。與現(xiàn)有方法相比，質(zhì)譜儀因具有快速、準(zhǔn)確、靈敏、抗基質(zhì)干擾能力強(qiáng)等多方面優(yōu)勢，已開始用于酶活測定。如Xu等＼[15＼]采用基質(zhì)輔助激光解析離子化傅立葉變換質(zhì)譜（MALDIFTMS），通過測定AChE底物及其產(chǎn)物的含量實(shí)現(xiàn)了酶活的測定，建立了基于此技術(shù)的有機(jī)磷農(nóng)藥篩查方法＼[16～18＼]，這種方法具有快速、高通量、高靈敏度的優(yōu)勢，但由于MALDIFTMS儀器成本高昂，普及率低，方法難以推廣應(yīng)用。另外，目前還未見基于此原理的質(zhì)譜法測定氨基甲酸酯類農(nóng)藥的報道。本實(shí)驗(yàn)采用已較為普及的電噴霧質(zhì)譜（ESIMS），建立基于酶抑制原理的快速篩查蔬菜中氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留的新方法，該法在滿足快速、靈敏、高通量要求的同時，大大降低了篩查成本，便于方法的推廣應(yīng)用。迄今為止，采用ESIMS，通過測定AChE活性，快速篩查CBPs的方法尚未見報道。

摘要采用電噴霧質(zhì)譜（ESIMS），通過測定乙酰膽堿酯酶（Acetylcholinesterase， AChE）的抑制率，建立了蔬菜中氨基甲酸酯類農(nóng)藥（Carbamate pesticides， CBPs）殘留的快速篩查方法。樣品經(jīng)QuEChERS方法簡單處理后，以硫代乙酰膽堿為底物，與AChE發(fā)生酶促反應(yīng)，用ESIMS法測定底物轉(zhuǎn)化成產(chǎn)物硫代膽堿的轉(zhuǎn)化率， 進(jìn)而計(jì)算得到AChE的抑制率。本實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了酶促反應(yīng)溫度、時間及濃度等條件，考察了10種常見CBPs農(nóng)藥濃度與AChE抑制率的關(guān)系，研究了實(shí)際蔬菜樣品存在的基質(zhì)效應(yīng)，以不含農(nóng)藥的空白蔬菜樣品的酶抑制率的3倍確立了方法的檢出限。結(jié)果表明，方法檢出限可達(dá)到0.01～0.05 mg/kg，優(yōu)于現(xiàn)行的農(nóng)藥殘留快速篩查國家標(biāo)準(zhǔn)，完全滿足食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)對食品中農(nóng)藥最大殘留限量的要求，且具有良好的抗基質(zhì)干擾能力，可有效避免假陽性結(jié)果的出現(xiàn)，并通過了液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法的驗(yàn)證。本方法簡便快速、靈敏可靠，適用于蔬菜中氨基甲酸酯類農(nóng)藥的快速、高通量篩查。關(guān)鍵詞酶抑制； 電噴霧質(zhì)譜； 蔬菜； 氨基甲酸酯類農(nóng)藥； 快速篩查； 高通量

氨基甲酸酯類農(nóng)藥（CBPs）自問世以來，因其具有選擇性強(qiáng)、殺蟲譜廣等特點(diǎn)＼[1＼]，被廣泛用于防治植物病蟲害，對提高農(nóng)作物產(chǎn)率，促進(jìn)農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)發(fā)展起到非常重要的作用。但近年來，由于氨基甲酸酯類農(nóng)藥的長期使用、濫用或超量使用，導(dǎo)致蔬菜水果等植物源性食品中殘留農(nóng)藥超標(biāo)嚴(yán)重，由此而造成的農(nóng)藥急慢性中毒事件時有發(fā)生。這類農(nóng)藥通過抑制體內(nèi)乙酰膽堿酯酶（AChE）的活性，使其不能分解乙酰膽堿（ACh）而導(dǎo)致組織中乙酰膽堿過量蓄積，引起人體中樞神經(jīng)系統(tǒng)癥狀甚至導(dǎo)致死亡＼[2＼]。為了避免此類中毒事件的發(fā)生和實(shí)現(xiàn)農(nóng)產(chǎn)品中殘留農(nóng)藥的有效監(jiān)測，建立蔬菜水果中快速、靈敏的氨基甲酸酯類農(nóng)藥檢測方法顯得異常迫切。

目前，已有許多分析方法用于氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留的檢測，如生物傳感器[3]、液相色譜法＼[4，5＼]、氣相色譜法＼[6＼]、氣相色譜質(zhì)譜法＼[7＼]及液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法＼[8～10＼]等。由于大多數(shù)CBPs屬于難揮發(fā)化合物，氣相色譜法或氣相色譜質(zhì)譜法只能檢測少數(shù)幾種CBPs； 對于基質(zhì)復(fù)雜的樣品，液相色譜法的靈敏度和可靠性均難以達(dá)到要求； 而最適宜分析CBPs的液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法，其分析時間也較長，且需要提供目標(biāo)農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品做對照，無法實(shí)現(xiàn)快速高通量測試。

氨基甲酸酯類農(nóng)藥的快速檢測方法是基于CBPs對AChE抑制的原理。AChE具有催化乙酰膽堿水解成膽堿的作用，過程如圖1所示，而一旦CBPs與其結(jié)合，將使其失去催化反應(yīng)能力。因而，CBPs的殘留可以通過AChE活性被抑制的情況間接進(jìn)行測定。目前，基于此原理測定農(nóng)殘的方法主要有速測卡法＼[11＼]、分光光度法＼[12，13＼]、pH法＼[13＼] 、酶生物傳感器法＼[14＼]。然而，前3種方法靈敏度過低，且極易受樣品基質(zhì)干擾而出現(xiàn)假陽性結(jié)果； 酶生物傳感器法雖然其靈敏度較高，但步驟多且繁瑣。與現(xiàn)有方法相比，質(zhì)譜儀因具有快速、準(zhǔn)確、靈敏、抗基質(zhì)干擾能力強(qiáng)等多方面優(yōu)勢，已開始用于酶活測定。如Xu等＼[15＼]采用基質(zhì)輔助激光解析離子化傅立葉變換質(zhì)譜（MALDIFTMS），通過測定AChE底物及其產(chǎn)物的含量實(shí)現(xiàn)了酶活的測定，建立了基于此技術(shù)的有機(jī)磷農(nóng)藥篩查方法＼[16～18＼]，這種方法具有快速、高通量、高靈敏度的優(yōu)勢，但由于MALDIFTMS儀器成本高昂，普及率低，方法難以推廣應(yīng)用。另外，目前還未見基于此原理的質(zhì)譜法測定氨基甲酸酯類農(nóng)藥的報道。本實(shí)驗(yàn)采用已較為普及的電噴霧質(zhì)譜（ESIMS），建立基于酶抑制原理的快速篩查蔬菜中氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留的新方法，該法在滿足快速、靈敏、高通量要求的同時，大大降低了篩查成本，便于方法的推廣應(yīng)用。迄今為止，采用ESIMS，通過測定AChE活性，快速篩查CBPs的方法尚未見報道。