血清游離脂肪酸酶法測定的方法學評價及生物學變異研究

鹿 剛， 高社軍， 巨英博

(河北醫科大學第四醫院檢驗科，河北石家莊050011)

游離脂肪酸(free fatty acid，FFA)又稱非酯化脂肪酸，其在血液中的濃度能反映人體脂肪代謝情況，與血脂代謝異常、胰島素抵抗、代謝綜合征以及糖尿病、心血管疾病的發病有密切關系［1-3］。以往檢測血清(或血漿)FFA多采用氣相色譜法［4］或高效液相色譜法［5］。但這些方法技術要求較為嚴格，檢測成本高。近年來發展起來的酶學比色法(簡稱酶法)具有檢測方便、成本低廉的優點而受到臨床實驗室青睞，目前臨床上檢測血清(或血漿)FFA多采用該方法。酶法測定原理中需要3種酶——乙酰輔酶A合成酶(acyl-CoA synthetase，ACS)、脂酰輔酶 A氧化酶(acyl-CoA oxidase，ACOD)和過氧化物酶(peroxidase，POD)。主要原理為FFA在ACS的催化下生成脂酰輔酶A，脂酰輔酶A在ACOD的催化下產生過氧化氫，過氧化氫在POD存在下作用于相應底物產生有色的醌類物質，其吸光度的大小與FFA的濃度成正比。

檢驗項目的生物學變異具體可分為個體間生物學變異(between-subject or inter-individual biological variation)和個體內生物學變異(withinsubject or intra-individual biological variation)，兩者的大小常用變異系數(CV)表示，分別用符號CVG、CVI(或 CVg、CVW)表示，主要用于制定臨床實驗室質量規范，同一患者系列結果的解釋及臨床課題的科研設計等。

我們采用美國臨床實驗室標準化協會(CLSI)EP5-A2和EP15-A文件中描述的方法評價了酶法測定FFA的精密度和正確度，并以13名健康青年志愿者為研究對象，在6周時間內每2周測定1次血清FFA濃度，計算個體間及個體內的生物學變異大小。

材料和方法

一、對象

選擇13名志愿者，男3名，女10名，年齡21～23歲，平均年齡為21.8歲，體質指數(BMI)為18.49～26.50 kg/m2，平均為21.72 kg/m2，無心血管疾病史，無手術史，不吸煙，不飲酒。實驗前進行的實驗室檢查顯示血脂類常規生化指標均正常。本實驗通過當地倫理委員會審查，所有志愿者均簽署知情同意書。

二、方法

1.試劑和儀器 血清FFA酶法試劑盒及校準品購自北京九強生物技術有限公司，批號分別為12-0401P、12-0720P、13-0125P。儀器為UniCel DxC800全自動生化分析儀(美國貝克曼庫爾特公司)，采用海爾DW-86L386超低溫冰箱(-80℃)保存樣品，采血針和真空生化采血管(含促凝劑)購自湖北金杏科技發展有限公司。

2.精密度評價 按照CLSI EP5-A2文件的精密度評價要求進行實驗［6］。以新鮮混合血清作為實驗樣品，使用另一份新鮮混合血清作為質控血清，都分裝成足夠實驗用的小份于-80℃保存，避免反復凍融。每一批測定FFA濃度(試劑批號12-0401P)時，樣品和質控各取1份，且樣品重復測定2次，質控測定1次。每天測定2批，間隔時間不少于2 h。連續測定20個工作日(2012年5月)，其中在前5 d結束后做初步精密度試驗，即在同一批中重復測定樣品20次，根據EP5-A2文件中方法判斷有無失控批，同時在實驗過程中根據每批的質控結果判斷有無失控批，如有則去除該日結果，繼續測夠20 d。實驗完成時共得到80個樣品測量結果，根據該結果計算批內、批間、日間和室內不精密度。

3.正確度評價 按照CLSI EP15-A文件的正確度評價要求進行實驗［6］。測定上海市臨床檢驗中心提供的3個濃度水平的血清FFA室間質評樣品(試劑批號:13-0125P)，測定過程中同時做室內質控，保證測定時未失控，將測定結果與相應的靶值比較計算偏差。

4.生物學變異實驗的樣品采集及檢測 所有參加實驗的志愿者在整個實驗階段保持正常飲食、學習和工作。采血前一天22∶00以后保持空腹直到采血完成，且不進行強體力運動。采血時間為周五早上7∶00，在檢驗科由一名固定的采血人員采集靜脈血4 mL，采血部位均為左上肢肘正中靜脈，使用的采血材料是采血針和真空生化采血管(含促凝劑)。樣品采集后放置30 min，2 100×g離心5 min，提取血清，保存在-80℃冰箱，直到檢測使用。實驗過程中每名志愿者共采集4次樣品，每2次的間隔時間為2周，整個實驗持續時間為6周(2012年11月至12月)。測定血清FFA時每名志愿者的4個樣品要在同批測定，所有樣品使用同一試劑盒(批號:12-0720P)，在最短時間內完成檢測。

三、統計學方法

1.批內(即重復性)、批間、日間和室內不精密度(即總不精密度)的計算［6］先計算標準差(s)，然后除以總的測量均數得到CV，用CV表示各個不精密度大小。批內標準差用Sr表示，公式:，在該式中及以下公式中I代表總的運行天數(本研究中為20 d)，j為每日的批次(本研究為2批)，xij1為第i日第j批第1次的結果。批間s用Srr表示，公式第i日第1批測量結果的均值。日間s用Sdd表示第 i日結果的均值所有結果的均值。室內s用ST表示，

2.偏差的計算［6］偏差=測量結果-靶值，百分比偏差=100%×(測量結果-靶值)/靶值。

3.個體間生物學變異(CVG)、個體內生物學變異(CVI)的計算［7-8］血清FFA濃度經自然對數轉換后成為正態分布數據。計算個體間生物學變異的方差(VG)和個體內變異的方差(VW)是通過SAS9.1軟件MIXED方差分析過程，把FFA濃度的對數值作為應變量，把不同采血時間作為自變量，把實驗對象作為隨機變量(RANDOM變量)。由于是經過對數轉換成為正態分布，故將上步得到的相應方差求平方根即可得到CVG和個體內變異(CVW)值。CVW又包括CVI和分析變異(CVA)。CVI通過下列公式計算，CVI=源于上述精密度評價實驗中得到的批內不精密度。P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、根據初步精密度試驗和每批質控數據判斷，在20 d共40批樣品測定中未出現失控批。樣品的FFA濃度總均值為0.796 mmol/L，批內、批間、日間和室內的不精密度見表1。廠商聲明的重復性為5%，總不精密度的合格標準按照室間質量評估允許FFA誤差(25%)的1/4計算，為6.25%［9］?？梢妼嶒灚@得的用戶重復性低于廠家聲明，總不精密度低于合格標準，故不需做重復性或總不精密度比較的卡方檢驗［6］。

表1 酶法測定血清FFA的批內、批間、日間和室內不精密度

二、實驗測定的室間質評樣品血清FFA濃度經與靶值比較得到的偏差、百分比偏差見表2。根據上海市臨床檢驗中心室間質評血清FFA的允許誤差(25%)判斷，實驗測定的3個質評樣品的偏差均在允許誤差范圍內。正確度評價的合格標準按照室間質量評估允許FFA誤差的1/2(12.5%)，則2號和3號質評樣品的偏差能達到合格標準。

表2 實驗測定室間質評樣品的偏差和百分比偏差結果

三、生物學變異實驗中測得的所有樣品的FFA濃度先經自然對數轉換，通過Shapiro-Wilk正態性檢驗為正態分布(P=0.458＞0.05)。血清 FFA 的 CVG、CVI和 CVA分別為8.43%、19.36%、2.15%。13名健康志愿者在6周時間內4次測定血清FFA水平的變化情況見圖1。

圖1 13名志愿者4次測定血清FFA濃度的變化情況

討 論

臨床檢驗診斷中應用的常規血脂代謝指標主要有高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、極低密度脂蛋白膽固醇(VLDL-C)及總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、脂蛋白(a)［Lp(a)］和載脂蛋白A1(apo A1)、載脂蛋白B(apo B)等。血清FFA是新的血脂類生化代謝指標［10］，主要來源于脂肪酶水解 TG或 TC而產生的脂肪酸，根據分子鏈中是否有不飽和雙鍵及不飽和雙鍵數量多少可分為飽和脂肪酸、單不飽和脂肪酸和多不飽和脂肪酸。酶法測定的血清FFA濃度包含有上述各種脂肪酸的總濃度。多數文獻已證實2型糖尿病患者血清FFA含量高于正常人［3，11-13］。FFA 參與胰島素抵抗［1］和動脈粥樣硬化斑塊的形成［2］等病理生理過程。酶法試劑盒最初從國外進口，進口試劑以其穩定和優秀的分析性能使得許多實驗室仍在使用，但進口試劑盒的價格昂貴，檢測成本較高。本研究選擇了國產酶法試劑盒，首先按CLSI EP5-A2文件和EP15-A文件中描述的方法對酶法的精密度和正確度進行簡單評價。實驗中獲得的重復性(2.15%)低于廠家聲明(5.00%)，同時總不精密度(5.46%)能達到公認的合格標準(6.25%)。其中批間不精密度(3.44%)和日間不精密度(3.67%)均高于批內不精密度(2.15%)，故批間和日間不精密度是本實驗室總不精密度的主要來源。李義龍等［9］評價了進口FFA酶法試劑盒的精密度，高、低兩濃度水平樣品的總不精密度分別為2.20%和3.30%，均優于本研究中獲得的總不精密度，而他們實驗中2個濃度樣品的總不精密度主要來源都僅是批間不精密度(2.10%和1.80%)。本研究測定了上海市臨床檢驗中心室間質評血清FFA項目的3個濃度水平的樣品，測定結果的百分比偏差從低濃度樣品到高濃度樣品依次為24.20%、-0.90%、-1.50%，均在室間質評規定的允許誤差范圍內。然而以此次測定室間質評樣品的結果做正確度評價，則低濃度樣品的百分比偏差超過了正確度評價的合格標準(12.50%)，其他2個樣品的百分比偏差都能達到該合格標準。

CVI是正常人體內被檢測物質濃度在連續幾次測定時發生變化的重要因素。有學者認為是人體內的某物質圍繞其穩態點的上下波動［14］。這種變化(或波動)大小在不同物質間會有很大差異，也就是說不同物質的CVI不同。目前大部分臨床檢驗項目的CVG和CVI都已經有大量文獻可供參考，然而由于受到研究對象、樣品采集間隔時間、實驗研究時間長短等實驗設計因素的影響，相同的檢驗項目在不同文獻中報道的生物學變異大小也不一致。了解某個項目的生物學變異大小最簡便的方法是查看生物學變異的匯編數據庫，例如Sebastian-Gambaro等［15］發表的匯編數據庫文章、美國Westgard網站上 Ricos等［16］的匯編數據庫。在Westgard網站上不僅有各個檢驗項目的CVG、CVI值，還給出了基于生物學變異計算的各個檢驗項目的合適精密度和正確度性能指標以及允許總誤差，這對于制定檢驗項目的臨床質量規范是非常有價值的參考依據。此外在檢驗醫學領域基于生物學變異還能計算的指標包括個體化指數(II)、參考變化值(RCV)、準確估計穩態點需要的最少測定次數等［14］。在臨床課題的科研設計中，一般認為單次測定能反映被測物在體內的代謝水平，可如果考慮了被測物的生物學變異，那會使所進行的科學研究更嚴謹。目前關于生物學變異的統計處理方法尚未統一，不同作者所采用的方法不完全相同。早在1989年該領域著名的學者Fraser和Harris共同發表了臨床化學工作中開展生物學變異研究的綜述性文章［7］。以后各國學者發表的生物學變異的論文絕大多數采用他們介紹的方法［17］。在該方法中計算個體間、個體內生物學變異及分析變異的方差采用嵌套設計資料的方差分析。在分析前要進行正態性檢驗，并進行Cochran、Reed檢驗檢查有無離群值，如有則去除，保證在進行方差分析時數據是正態分布且沒有異常值。應用該方法把本研究的原始數據重新計算得到血清FFA的CVG和CVI分別為9.72%和18.84%，與本研究采用混合線性模型方差分析過程［8］得到的結果相似。相比較而言，本研究所用方法更簡便，適用性更廣。血清FFA的生物學變異研究文獻很少，在匯編數據庫中也未查到該項目。Widjaja等［8］曾報道血清 FFA的 CVG、CVI分別為32%、45%，與本研究得到實驗結果略有不同(CVG、CVI分別為8.43%、19.36%)。本研究的CVI值低于文獻報道的原因可能與樣品采集周期和研究時間長短有關，在Widjaja等［7］的研究中連續12 d每天采集健康人血樣品，而本研究測定了更長一段時期(6周)內的CVI，結果一般會偏小。本研究CVG值也低于文獻報道，這可能與選擇的研究對象之間更相近有關。本研究生物學變異的計算中用到了CVW。CVW實際上是除外病理因素，包括所有能引起被檢物質濃度變化的變異總和［8］。具體可分為分析前變異、CVA和CVI。本研究未計算分析前變異，是由于從樣品采集時間、采集部位、空腹時間及飲食運動狀態等到樣品離心、樣品保存條件等都有嚴格限制要求，盡量縮小分析前變異，故分析前變異成分可以忽略不計。還有在實驗中還要求每名健康志愿者的4個樣品在同一批測定，為了是在計算中用到的分析變異大小可以等同于批內不精密度大小。

本研究的不足和局限性在于:第一，CLSI EP5-A2精密度評價文件常用于自建檢驗系統精密度的確立，并推薦使用2個濃度水平的實驗樣品，盡可能選擇接近醫學決定水平的濃度，然而該文件也可用于檢驗系統精密度的驗證評價，做驗證評價的缺點是實驗步驟及統計過程繁瑣、復雜。如果實驗目的僅是核實廠家聲明的精密度和正確度，可選擇CLSI EP15-A文件中敘述的簡便方法。為了獲得更豐富的精密度評價結果，本研究選擇了EP5-A2文件中敘述的方法，但由于實驗條件限制簡化了實驗內容，只做了1個濃度水平的實驗樣品。第二，正確度評價的主要方法是CLSI EP9-A文件中敘述的方法，但對于本研究評價血清FFA的正確度，很難找到所需參考方法或比較方法，也就很難按照EP9-A文件的方法去做正確度驗證，故本研究選擇了EP15-A文件中描述的檢測權威機構提供的室間控制品的實驗方案。這不同于測定商品化的定值質控品，對于后者由于廠家賦值程序不同，故需謹慎采用。第三，因為本研究做方法學評價時選擇方法較簡單，所以實驗中獲得的精密度和正確度僅用于本實驗室的性能核實，具有一定的局限性，對使用該試劑盒的其他實驗室僅供簡單參考。

本研究中使用的酶法測定FFA的精密度和正確度能滿足用戶實驗室質量規范要求。血清FFA的CVG和CVI可為制定臨床實驗室質量規范、同一患者系列檢驗結果的解釋以及臨床課題的科研設計等提供有用的參考依據。

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