新生兒臍血IgE與AICDA基因多態(tài)性的相關(guān)性

唐 琳，李 佳，戴慧蓉，李 莉

(上海交通大學(xué)附屬第一人民醫(yī)院，上海200080)

過(guò)敏性疾病的患病率在過(guò)去的20年中明顯增加，尤以兒童更為明顯［1］。I型超敏反應(yīng)是由過(guò)敏原與其特異性免疫球蛋白E(Immunoglobulin E，IgE)結(jié)合，激活肥大細(xì)胞而引發(fā)的，IgE是重要的介導(dǎo)物質(zhì)，血清IgE水平是過(guò)敏原診斷、疾病嚴(yán)重程度監(jiān)測(cè)和療效觀察的重要指標(biāo)。IgE的合成是通過(guò)B細(xì)胞類別轉(zhuǎn)換重組完成的，而活化誘導(dǎo)胞嘧啶核苷脫氨酶(activation-induced cydine deaminase，AID)是類別轉(zhuǎn)換重組的關(guān)鍵酶［2］。最近，有研究表明，編碼AID的基因AICDA的變異即AICDAD的單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)與過(guò)敏性疾病及血清IgE水平明顯相關(guān)［3］，新生兒臍血IgE水平與兒童過(guò)敏性疾病的發(fā)生相關(guān)性的研究也陸續(xù)有報(bào)道［4-5］。過(guò)敏與遺傳相關(guān)、受環(huán)境等多因素影響的疾病，如果能夠?qū)ふ业疥P(guān)鍵基因，明確過(guò)敏性疾病的遺傳特性，對(duì)于過(guò)敏的預(yù)測(cè)、預(yù)防和個(gè)體化關(guān)懷與治療無(wú)疑具有重要研究?jī)r(jià)值。為更好地探討過(guò)敏性疾病的遺傳相關(guān)因素，需要排除接觸外界物質(zhì)，包括過(guò)敏原等眾多后天影響因素，我們選擇了臍血為研究對(duì)象。根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道臍血IgE水平受母親的影響遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于父親［6-7］。因此，本研究選取新生兒臍血為研究對(duì)象，著重分析AICDA基因多態(tài)性與新生兒臍血IgE的水平的相關(guān)性，以期探尋兒童過(guò)敏性疾病的易感基因。

材料和方法

一、研究對(duì)象

2012年10月至2013年3月，上海國(guó)際和平婦幼保健院和上海市第一人民醫(yī)院收治的足月產(chǎn)婦，按照有無(wú)過(guò)敏史分為2組(過(guò)敏性疾病為哮喘、蕁麻疹、過(guò)敏性鼻炎或皮炎;常見(jiàn)的過(guò)敏原為屋塵螨、動(dòng)物毛發(fā)、金屬、海鮮或花粉)，其中無(wú)過(guò)敏史產(chǎn)婦97例，有過(guò)敏史產(chǎn)婦70例。所有入組者均簽署知情同意書(shū)，并填寫(xiě)調(diào)查問(wèn)卷。

二、方法

1.臍血采集 自然產(chǎn)產(chǎn)婦分娩時(shí)采集，于臍帶結(jié)扎后留取近胎盤(pán)端的臍血，乙二胺四乙酸二鉀(EDTA-K2)抗凝，立刻在4℃離心機(jī)上4 250×g離心6 min，分離血漿和血細(xì)胞，－80℃冰箱保存?zhèn)錂z。

2.臍血基因組DNA抽提 采用Axy Prep全基因組DNA小量試劑盒提取臍血基因組DNA，溶于TE緩沖液，置－80℃保存待用。

3.引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)Genebank公布的AICDA基因序列，設(shè)計(jì)3個(gè)位點(diǎn)引物各1對(duì)，rs2518144上游引物5'-TGG ACT TTG GTT ATC TTC GC-3'，下游引物5'-GCA CTC ACA GTT GAC CAT TA-3';rs2028373上游引物5'-CTG CTG GAA TAC TTT TGT AG-3'，下游引物 5'-ACT GAA TTT TCA TGC AGC CC-3';rs11046349上游引物5'-CTC TAA GAA AGT GAGAGT T-3';下游引物5'-ATC TCT GCT GAA GAC AGT GG-3'。PCR 引物和LDR探針由Invitrogene生物公司合成。

4.多態(tài)性位點(diǎn)基因型檢測(cè) 采用聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)技術(shù)和高溫連接酶反應(yīng)(ligase detection reaction，LDR)方法檢測(cè)樣本DNA序列。多重PCR反應(yīng)體系為20 μL，反應(yīng)循環(huán)參數(shù)為95℃預(yù)變性2 min，94℃變性30 s，50 ℃退火 90 s，65 ℃ 延伸 1 min，共循環(huán)35次，最后65℃延伸10 min。3%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，觀察PCR產(chǎn)物的效果，確定其作為模板在LDR反應(yīng)中加入的量。LDR反應(yīng)體系為10 μL，95 ℃預(yù)變性2 min，94 ℃變性14 s，50 ℃退火25 s，共30次循環(huán)。產(chǎn)物經(jīng)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司ABI 3730測(cè)序儀(美國(guó) AppliedBiosystems公司)測(cè)序，結(jié)果運(yùn)用Genemapper進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

5.臍血總IgE的測(cè)定 采用電化學(xué)發(fā)光免疫分析法(ECLIA)，經(jīng) Roche Cobas 6000儀器(Roche公司，美國(guó))檢測(cè)。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

把有無(wú)過(guò)敏史的產(chǎn)婦分成2組，組間AICDA基因型頻率與等位基因頻率的比較用χ2檢驗(yàn)，各位點(diǎn)基因型對(duì)血漿總IgE的影響采用方差分析;以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、AICDA基因多態(tài)性與產(chǎn)婦過(guò)敏史的相關(guān)性

經(jīng)χ2檢驗(yàn)，在無(wú)過(guò)敏史組和有過(guò)敏史組rs2518144，rs2028373，rs11046349 位點(diǎn)基因型及等位基因位點(diǎn)頻率分布符合Handy-Weinberg平衡定律，2組均發(fā)現(xiàn)各種基因型。rs2518144位點(diǎn)3組基因型(AA/AG/GG)及rs11046349位點(diǎn)3組基因型(TT/TG/GG)分布頻率及等位基因頻率在無(wú)過(guò)敏史組和有過(guò)敏史組產(chǎn)婦間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均＞0.05)，見(jiàn)表1、2。rs2028373位點(diǎn)3 組基因型(AA/AG/GG)及等位基因分布頻率與對(duì)照組相比有明顯差異(P值分別為0.02和0.006)，見(jiàn)表3。

表1 按產(chǎn)婦有無(wú)過(guò)敏史比較新生兒臍血rs2518144位點(diǎn)基因型與等位基因頻率分布 ［例(%)］

表2 按產(chǎn)婦有無(wú)過(guò)敏史比較新生兒臍血rs11046349位點(diǎn)基因型與等位基因頻率頻率分布 ［例(%)］

表3 按產(chǎn)婦有無(wú)過(guò)敏史比較新生兒臍血rs2028373位點(diǎn)基因型與等位基因頻率分布 ［例(%)］

二、AICDA基因多態(tài)性與新生兒臍血IgE水平的相關(guān)性

AICDA rs2518144，rs2028373，rs11046349 位點(diǎn)基因型與臍血IgE水平無(wú)明顯相關(guān)性。

表4 位點(diǎn)基因型對(duì)血漿總IgE的影響(±s)

表4 位點(diǎn)基因型對(duì)血漿總IgE的影響(±s)

GG 1.07±1.24 AA 0.56±1.21 1.446 0.238 rs2028373 AG 0.45±0.91 GG 0.77±1.21 TT 0.57±1.12 0.089 0.915 rs11046349 TG 0.57±0.90 GG 0.25±0.21

討 論

世界變態(tài)反應(yīng)組織(World Allergy Organization，WAO)在世界首個(gè)過(guò)敏性疾病日公布了對(duì)30個(gè)國(guó)家進(jìn)行的過(guò)敏性疾病流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果，在這些國(guó)家的12億總?cè)丝谥校s2.5億人 (占22%)患有IgE介導(dǎo)的過(guò)敏性疾病，包括過(guò)敏性鼻炎、哮喘、結(jié)膜炎、濕疹、食物過(guò)敏、藥物過(guò)敏和嚴(yán)重過(guò)敏反應(yīng)等。全球每年支出約79億美元用于過(guò)敏性疾病的治療及其間接經(jīng)濟(jì)支出。因此，世界衛(wèi)生組織(World Health Organization，WHO)已把過(guò)敏性疾病列為21世紀(jì)需重點(diǎn)研究和防治的三大疾病之一。目前，上海兒童哮喘的發(fā)病率已達(dá)到6%左右，其中至少80%兒童患者均由過(guò)敏因素誘發(fā)。過(guò)敏性疾病通常病程較長(zhǎng)，并且容易反復(fù)發(fā)作，影響患病兒童的生長(zhǎng)發(fā)育、生活和學(xué)習(xí)，給患者和家庭的生活質(zhì)量、兒童的身心健康與教育發(fā)展以及社會(huì)的經(jīng)濟(jì)和進(jìn)步都有負(fù)面作用。因此，從過(guò)敏性疾病發(fā)生的機(jī)制入手，尋找易感基因、探討遺傳機(jī)制，可以為過(guò)敏性疾病的預(yù)測(cè)，個(gè)體化的預(yù)防與干預(yù)措施及其藥物的研發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)和理論支撐。

免疫球蛋白E(IgE)是過(guò)敏性疾病的重要介導(dǎo)物質(zhì)，同時(shí)也是判斷疾病嚴(yán)重程度及用藥效果的指標(biāo)，其合成是經(jīng)過(guò)B淋巴細(xì)胞類別轉(zhuǎn)換重組(class switch recombination，CSR)完成的。而AID的發(fā)現(xiàn)是B細(xì)胞CSR機(jī)制中的重大發(fā)現(xiàn)，其誘導(dǎo)和啟動(dòng)了CSR過(guò)程。編碼AID的AICDA基因突變與Hyper-IgM綜合征(Autosomal recessive form of hyper-IgM syndrome，HIGM2)密切相關(guān)，該病患者血清IgM水平明顯升高，而其它免疫球蛋白亞型則原發(fā)性免疫缺陷，這表明AICDA基因的突變導(dǎo)致了各類型免疫球蛋白類別轉(zhuǎn)換的缺失。一些研究已經(jīng)報(bào)道了血清IgE水平，過(guò)敏性疾病以及AICDA基因多態(tài)性之間的關(guān)聯(lián)［8-9］:2001年，Emiko Noguchi等［10］研究發(fā)現(xiàn)日本人群中存在rs2518144、rs2028373、rs11046349 這 3 個(gè)位點(diǎn)的突變型;2003年，Isidoro-Garcia等［11］在西班牙人群中也研究了相關(guān)SNP位點(diǎn)。

在母嬰遺傳研究中，過(guò)敏的遺傳易感性早已眾所周知。在妊娠第11周，胎兒就開(kāi)始產(chǎn)生免疫球蛋白E。研究證實(shí)，臍血IgE增高的嬰兒其日后發(fā)生哮喘等過(guò)敏性疾病的幾率明顯增多，提示遺傳因素對(duì)個(gè)體的IgE基礎(chǔ)水平起著決定性的作用［12-13］。Scirica CV 等［14］也指出臍血 IgE 水平的高低，可作為篩查過(guò)敏高危患兒的指標(biāo)。

在過(guò)敏性疾病的發(fā)生發(fā)展中，先天的遺傳背景和后天的生活方式、環(huán)境因素起了非常重要的作用。IgE不能通過(guò)胎盤(pán)屏障，可以排除母體IgE水平對(duì)臍血IgE水平的影響;胎兒分娩伊始，臍血IgE并未受到后天因素的影響，故本研究選取新生兒臍血作為研究對(duì)象。為了解新生兒家族過(guò)敏史與臍血IgE的關(guān)系，探索AICDA基因多態(tài)性位點(diǎn)基因型對(duì)臍血IgE水平的影響，本研究檢測(cè)了新生兒臍血的總IgE水平和AICDA基因rs2518144，rs2028373，rs11046349 3個(gè)位點(diǎn)的基因型;發(fā)現(xiàn)患有過(guò)敏性疾病的產(chǎn)婦其新生兒臍血的AICDA rs2028373位點(diǎn)GG基因型頻率明顯低于對(duì)照組，提示G等位基因可能是新生兒過(guò)敏性疾病發(fā)生的保護(hù)性因素。

目前AICDA基因在過(guò)敏性疾病過(guò)程中的作用尚未完全明確，其基因多態(tài)性與過(guò)敏的關(guān)系仍在不斷研究。而本研究是對(duì)AICDA基因與過(guò)敏性疾病相關(guān)性的初步調(diào)查，更大樣本的相關(guān)研究，功能機(jī)制探尋，以及多個(gè)相關(guān)SNP位點(diǎn)在RNA的轉(zhuǎn)錄水平以及細(xì)胞因子水平的關(guān)系仍在進(jìn)一步研究之中，對(duì)AICDA基因研究的不斷深入將為過(guò)敏基因的確立，過(guò)敏的預(yù)測(cè)，防治和治療提供新的線索和途徑。本課題是過(guò)敏性疾病遺傳易感和遺傳相關(guān)因素研究的一次探索和嘗試，研究對(duì)象、樣本選取、備選基因及其位點(diǎn)、親屬相關(guān)參數(shù)、樣本量以及出生后跟蹤分析周期、間歇和頻度等都將在后續(xù)的課題研究中慎重考慮和完善。以期為過(guò)敏性疾病預(yù)測(cè)、預(yù)防和個(gè)體化關(guān)懷、治療提供有益的實(shí)驗(yàn)依據(jù)和幫助。

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