正交試驗優選扶陽軟堅清脈方的提取工藝

常錦明 宋清宏 曹燁民 魏 莉

(1上海中醫藥大學中藥學院，上海，201203;2上海市中醫老年醫學研究所，上海，200031;3上海市中西醫結合醫院脈管科，上海，200082)

扶陽軟堅清脈方應用奚九一教授“因痰致瘀”觀點的經驗方[1]，由制附子、肉桂、豨薟草、垂盆草、干姜等9味藥物組成，主治肢體動脈硬化閉塞，是益氣溫陽、健脾化飲的代表方。肢體動脈硬化閉塞癥(ASO)是一種肢體慢性或急性缺血的疾病[2]。隨著社會老齡化，我國ASO患者在逐年增加，其死亡率和病殘率均較高，位居周圍血管病的首位[3]。本方以附子、肉桂回陽救逆[4]為君藥，以昆布、豨薟草祛風軟堅為臣藥，以垂盆草、煅牡蠣、蒲黃化痰祛瘀為佐藥，以干姜、炙甘草溫中調和為使藥，臨床用于治療多種心血管疾病，對肢體動脈硬化閉塞癥有顯著療效，能有效改善肢體動脈硬化閉塞癥的臨床缺血癥狀和體征，有改善肢體動脈供血的作用[5]。本實驗根據每味藥君臣佐使的藥效關系和主要藥效成分，以奇壬醇、肉桂酸含量[6]及干膏得率為考察指標，通過正交試驗優選提取工藝，為制劑規范化加工提供技術參數。

1 儀器與材料

1.1 儀器 Agilent 1100高效液相色譜儀;電子分析天平(Sartorius CPA225D);旋轉蒸發儀(BUCHI B49);L－120042超聲清洗儀(100 w，50 Hz，江蘇昆山力波超聲設備有限公司)。

1.2 試藥 奇壬醇對照品:購于中國藥品生物制品檢定所(批號:111726－200601);肉桂酸對照品:購于中國藥品生物制品檢定所(批號:110786－200503);制附子、肉桂、豨薟草、垂盆草、干姜、炙甘草、生蒲黃、昆布、煅牡蠣購于上海康橋中藥飲片有限公司(經鑒定符合《中華人民共和國藥典》2010年版規定)。

1.3 試劑 KromasilC18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm):大連依利特分析儀器有限司;甲醇為色譜純，國藥集團化學試劑有限公司(批號:40064292);乙腈為色譜純:上海豪申化學試劑有限公司(批號:40064193);磷酸為色譜純:上海豪申化學試劑有限公司(批號:20100315);水為純化水;其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 奇壬醇和肉桂酸含量測定

2.1.1 對照品溶液的制備 分別取奇壬醇和肉桂酸對照品適量，精密稱定，加70%甲醇溶液制成1 mL含226.8 μg 和164.8 μg 的對照品溶液，即得。

2.1.2 供試品溶液的制備 按處方比例稱取藥材，根據正交試驗表提取得水提液9組，均濃縮至200 mL以下，定容與250 mL的容量瓶中，分別精密移取20 mL放入真空干燥箱中，70℃干燥至恒重，各移取所得浸膏粉于50 mL容量瓶中，加70%甲醇稀釋，超聲30 min，放冷，加70%甲醇至刻度，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜濾過，取續濾液，即得。

2.1.3 陰性對照溶液的制備 按處方比例除去豨薟草和肉桂稱取藥材，再按“2.1.2”供試品溶液制備的方法分別制得不含豨薟草和肉桂的陰性對照溶液。

2.1.4 色譜條件與系統適用性試驗 根據2010版《中華人民共和國藥典》及有關文獻文獻[7－10]確定奇壬醇和肉桂酸含量測定的色譜條件:色譜柱為Kromasil C18色譜柱(4.6 mm × 250 mm，5 μm)，流動相分別為乙腈∶甲醇∶水(23∶18∶59)和乙腈∶0.1% 磷酸(35∶65);流速為1.0 mL/min;檢測波長為215 nm和285 nm;柱溫:25℃;理論板數按奇壬醇和肉桂酸分別不得低于5 000和3 000。

2.1.5 專屬性試驗 分別精密吸取奇壬醇和肉桂酸的對照品溶液、供試品溶液和陰性對照品溶液，進樣量分別為20 μL和10 μL，兩者在上述色譜條件下，峰型良好，陰性樣品無干擾，見圖1至圖6。

圖1 奇壬醇對照品的HPLC色譜圖

圖2 供試品溶液HPLC色譜圖

圖3 陰性樣品的HPLC色譜圖

2.2 線性關系的考察 分別精密吸取奇壬醇和肉桂酸的對照品溶液 0.5、1.0、1.5、2.0、3.0 mL 于 10 mL的容量瓶中，加70%的甲醇定容，搖勻，分別得到濃度梯度為11.34～68.04 μg/mL 和1.64－9.89 μg/mL的對照品溶液。按照上述色譜條件進行測定，分別以對照品的濃度為橫坐標(X)，以各自峰面積積分值為縱坐標(Y)，繪制標準曲線，擬合方程為:Y=16 312X－6.689，r=0.999 8 和 Y=72 470X，r=0.999 8，在11.34 mg/mL－ 68.04 μg/mL 和 1.65 μL/mL－ 9.89 μL/mL的范圍內與峰面積呈良好線性關系。

圖4 肉桂酸對照品的HPLC色譜圖

圖5 供試品的HPLC色譜圖

圖6 陰性樣品的HPLC色譜圖

2.3 精密度試驗 分別精密吸取同一濃度奇壬醇和肉桂酸對照品溶液，按照上述色譜條件分別連續重復進樣6次，測定各自峰面積，結果該方法測得6次峰面積的相對標準偏差(Relative Standard deviation，RSD)分別為:RSD=0.17%和0.86%，表明奇壬醇和肉桂酸的含測方法精密度良好。

2.4 重復性試驗 取同一批號處方量藥材6份，按“2.1.2”供試品溶液制備方法制備，按上述色譜條件進樣，測定各自峰面積，RSD分別為:1.83%和0.30%，表明含測方法重復性良好。

2.5 穩定性試驗 取處方量取藥材，按“2.1.2”供試品溶液方法制備，精密吸取該供試品溶液，分別在0、4、8、10、12、24 h 內不同的時間點進樣，按上述色譜條件測定峰面積，結果該方法測得供試品中奇壬醇和肉桂酸峰面積RSD分別為:1.43%和0.36%，表明供試品溶液中的奇壬醇和肉桂酸在24 h內穩定。

2.6 加樣回收率試驗 精密稱定3個不同比例(80%、100%、120%)已知含量的樣品9份，分別加入一定量的奇壬醇和肉桂酸對照品溶液，按加樣回收試驗計算回收率，結果平均加樣回收率分別為:98.10%和98.47%，RSD分別為:0.93%和1.01%，說明本方法具有良好的準確度，見表1和表2。

表1 奇壬醇回收率試驗結果

表2 肉桂酸回收率試驗結果

2.7 供試品中奇壬醇和肉桂酸的含量測定 取“2.1.2”項下供試品溶液，按上述色譜條件進樣，測定其峰面積，并按標準曲線計算奇壬醇和肉桂酸的含量。

2.8 得膏率的測定 取按L9(34)正交試驗表提取所得水提液，濃縮至200 mL以下，定容與250 mL的容量瓶中，精密移取20 mL于干燥至恒重的蒸發皿中，放入70℃的真空干燥箱干燥至恒重，取出置干燥器中，冷卻30 min后，精密稱定，再在上述溫度干燥1 h，冷卻，稱定質量，至連續2次稱質量的差異不超過3 mg為止，計算干膏得率。

2.9 提取工藝研究

2.9.1 因素水平的確設定和正交試驗結果 本方長期用于治療肢體動脈硬化閉塞，效果良好，臨床用水煎服，因此本實驗提取溶劑為水。根據附子和煅牡蠣用法[11]，并參考相關文獻[12－15]取日處方量制附子、煅牡蠣加10倍量水先煎2 h，收集煎液，殘渣與處方量肉桂、豨薟草、垂盆草、干姜等藥材合并，以奇壬醇、肉桂酸的含量及得膏率為綜合評價指標，按L9(34)正交試驗表進行試驗，考察加水量(A)、提取時間(B)、浸泡時間(C)、提取次數(D)對提取結果的影響，優選的最佳工藝，因素水平見表3。在根據王暉等對多指標綜合評價方法研究及權重系數如何選擇和確立[16]的基礎上，結合自身試驗的特點和考察指標間的關系，合理、科學地設置各指標的權重系數分別為，肉桂酸∶奇壬醇∶得膏率(0.4∶0.3∶0.3)(綜合評分=奇壬醇的含量×0.3+肉桂酸的含量×0.4+得膏率×0.3)，結果見表4。

表3 因素水平表

表4 正交試驗設計與結果

2.9.2 正交試驗結果的方差分析 對以上正交數據進行方差分析，直觀分析結果表明，影響水提工藝程度的四個因素的次序為:D＞A＞C＞B，最佳提取工藝為:D3A3C3B2。方差分析結果表明，D因素對水提工藝有顯著的影響，A、B、C因素無顯著性差異，但綜合考慮到節約成本、方便生產等各方面原因，扶陽軟堅清脈方的最佳提取工藝為:D3A1C2B2，即加8倍的水，浸泡半個小時，提取3次，每次提取2 h，結果見表5。

表5 方差分析結果表

2.9.3 驗證試驗 為考察上述優選提取工藝的穩定性，按該工藝條件進行重復性試驗(n=3)，分別測定奇壬醇、肉桂酸的含量和得膏率。試驗結果表明，該工藝合理可行，重現性較好，試驗結果見表6。

表6 驗證試驗

3 討論

軟堅清脈方處方中藥味較多，并且所含藥味活性成分比較復雜，試驗以多個有效成分和指標進行考察，優選最出佳提取工藝，確保了新藥的臨床療效。本試驗用多指標進行正交試驗工藝優選時，首先要解決指標結果間是否矛盾和兩個指標成分含量和得膏率之間量綱不一致的問題，為此，采用多指標綜合評分法，設置各個指標結果的權重系數，綜合評分后再進行統計分析，這樣優選出的工藝條件更加合理。從肉桂中可分離出肉桂醛和肉桂酸等藥效成分，但由于肉桂醛在提取過程中極易轉化成肉桂酸，很不穩定，而肉桂酸穩定可控，為此本試驗選用肉桂酸做指標藥效檢測成分。在檢測奇壬醇的過程中，試驗曾選用過的流動相還有乙腈∶水(25∶75)，乙腈∶甲醇∶水(18∶18∶64)，乙腈∶甲醇∶水(20∶18∶62)結果均不太理想，峰得不到較好的分離，且拖尾比較嚴重，采用本試驗方法成分分離效果好，結果準確，靈敏度較高。

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