益腎化濁方對SAMP8小鼠NEI網絡相關指標的影響

張琳琳 周 震 李 程 張玉蓮

(1天津中醫藥大學第二附屬醫院，天津，300150;2天津中醫藥大學，天津，300073)

老年性癡呆即阿爾茲海默病(Alzheimer’s Disease，AD)，是中樞神經系統退行性疾病，以進行性的認知功能障礙和記憶能力損害為主要的臨床特征[1]，為癡呆最常見的類型。據中國國家防控中心(CDC)統計，2006年我國AD患病人數已超過500萬，60歲以上的老年人群中，年齡每增加5歲，AD的患病危險可增加1.85倍[2]。AD已成為21世紀威脅人類的最嚴重疾病之一。

AD的病理特征主要包括Aβ聚集形成的老年斑(SP)及tau蛋白異常磷酸化形成的纖維纏結(NFT)最終導致神經元的減少，以往研究多集中于此。而最新研究顯示NEI網絡在機體衰老過程中具有重要地位，也是老年相關疾患研究中不可避免的重要環節[3]。王擁軍團隊流行病學調查顯示生、長、壯、老的生命過程，其突出表現為NEI網絡某些指標的調節變化[4]。因此通過對AD患者紊亂NEI網絡的調節，從而達到微環境神經生化指標的良性改變，對于預防和治療老年性癡呆具有一定作用。而中藥復方正是通過采取多靶點作用于失穩NEI網絡的方法，起到整體良性調和陰陽的作用，使已經失去平衡的機體重返穩態[5]。

我們在本實驗觀察了補腎化濁方對SAMP8小鼠神經內分泌免疫系統的影響，并對其機理進行了初步的探討。

1 材料與方法

1.1 動物分組 健康雄性SAMP8小鼠(由天津中醫藥大學第一附屬醫院實驗研究中心提供)6、9、12三個月齡各30只，共計90只，體重(30±2)g。三個月齡分別按隨機數字表法隨機分為安慰劑組、安理申組和益腎化濁方組，共9組，每組10只。見表1。于清潔級實驗動物房適應性喂養1周后進行實驗，每12 h明暗交替，溫度20～22℃，濕度50%左右，飲水、飼料及高溫蒸汽滅菌。

1.2 藥物制備 益腎化濁方由淫羊藿10 g、補骨脂10 g、女貞子 10 g、石菖蒲12 g、炙黃芪 10 g、川芎 10 g 六種中藥組成。上述藥物310 g加10倍水，煎煮3次，每次0.5 h，煎煮液濃縮至500 mL，生藥濃度為0.62 g·mL－1。以上均由天津中醫藥大學第二附屬醫院制劑室制備，4℃冰箱保存備用。鹽酸多奈哌齊[商品名:安理申，衛才(中國)藥業有限公司提供，5 mg/片]，批準文號:國藥準字H20050978，批號:100335A。

人和動物按體表面積折算的等效劑量比值表計算，其中人(70 kg)與小鼠(20 g)間系數為0.0026。按照患者每日62 g(1劑)生藥計算，30 g小鼠為每日0.2886 g生藥，即生藥濃度為9.62 g/kg，因1 mL中藥濃煎劑含0.62 g生藥，故每日小鼠需13 mL/kg中藥濃煎劑。安理申組給藥方法為取2片安理申用研缽研磨后混懸于100 mL生理鹽水中，即濃度為0.1 mg/mL，按0.01 mL/g給小鼠進行灌胃，2組均連續灌胃4周。

1.3 主要實驗試劑和儀器 Elisa試劑盒(包括SAMP8小鼠乙酰膽堿、雌二醇、促腎上腺皮質激素和白細胞介素－2酶聯免疫分析試劑盒):購自天津市灝洋生物制劑科技有限責任公司;05－1sR離心機:購自美國Beekman公司;speetraMaxMS全自動酶標儀及Potter－Elvejhem勻漿器:購自美國Mo－eeularDeviees公司;ANDELIN細胞超聲破碎儀:購自上海友思生物技術有限公司。

1.4 各指標檢測方法 進行4周生理鹽水及藥物灌胃后，將各組小鼠進行股動脈穿刺取血1 mL，用05－1sR離心機3500 r/min離心15 min后，取上清液放入－80℃冰箱進行保存。利用酶聯免疫吸附實驗(ELISA)試劑盒對各組小鼠的血清進行NEI網絡部分指標的檢測，包括:乙酰膽堿、雌二醇、促腎上腺皮質激素及白細胞介素－2。方法操作均按各試劑盒說明書進行。

1.5 統計學方法 實驗數據采用SPSS 19.0軟件進行統計學處理。計量資料用(±s)表示，組間比較符合正態分布采用t檢驗(組間進行方差齊性檢驗，以0.05作為檢驗水準，方差不齊時選用校正的t檢驗)，不符合正態分布采用秩和檢驗;計數資料進行χ2檢驗。P＜0.05表示差異有統計學意義，P＜0.01表示差異有顯著性統計學意義。

表1 實驗小鼠分組表(只)

表2 不同月齡小鼠NEI網絡相關指標測定(n=10，±s)

表2 不同月齡小鼠NEI網絡相關指標測定(n=10，±s)

注:同一月齡小鼠，與安慰劑組比較，*P＜0.05;同一月齡小鼠，與安慰劑組比較，△△P≤0.001;▲P＞0.001。

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2 結果

1)本研究結果表明老年癡呆小鼠的乙酰膽堿、雌二醇及腎上腺皮質激素的水平明顯減低，IL－2的水平明顯增高。見表2。

2)安理申與益腎化濁方9、12月齡小鼠的乙酰膽堿水平較同月齡安慰劑組都有明顯的升高作用(P＜0.05)。見表2。

3)益腎化濁方組9、12月齡小鼠在乙酰膽堿、雌二醇及腎上腺皮質激素水平較同月齡安慰劑組明顯升高(P＜0.05);IL－2較同月齡安慰劑組明顯減低(P＜0.05)。見表2。

4)9月齡小鼠安理申組的乙酰膽堿水平及同月齡益腎化濁方組的乙酰膽堿、雌二醇、腎上腺皮質激素及IL－2水平較同月齡安慰劑組變化差異有統計學意義(P≤0.001);12月齡月齡小鼠安理申組的乙酰膽堿水平及同月齡益腎化濁方組的乙酰膽堿、雌二醇、腎上腺皮質激素及IL－2水平較同月齡安慰劑組變化差異有統計學意義(P＞0.001)。P值越小，差異越明顯。見表2。

3 討論

NEI網絡學說最初在1977年由Basedovsky提出，該學說認為，看似獨立的神經、內分泌、免疫三大系統，實際上是一個有著廣泛聯系的有機整體，三大調節系統之間存在著精密完整復雜的信息傳遞機制[6]。生理狀態下，NEI網絡各系統間通過自分泌或旁分泌方式維持著動態平衡，通過相互刺激、相互制約，達到系統內部的自我調劑和相對穩定;但病理狀態下，某些因子的異常變化可誘發一系列的連鎖反應，使穩態偏離，造成疾病出現[7]。NEI網絡自穩調節紊亂是所有疾病的共同本質。AD是一種常見于老年人的神經系統變性疾病，其病程長，致殘率高，目前治療該病尚無有效的藥物和方法。

乙酰膽堿(Ach)是腦內與學習、記憶密切相關的神經遞質，生物化學研究發現AD患者腦內乙酰膽堿能神經元缺少，Ach含量不足。膽堿酯酶抑制劑可抑制中樞突觸間隙的膽堿酯酶，阻止Ach的分解，修復AD患者中已喪失的膽堿能功能[8]。血漿腎上腺皮質激素(ACTH)和皮質醉含量的減低可引起下丘腦一垂體一腎上腺皮質軸(HPA)系統功能的改變[9]，亢進的HPA軸可參與衰老相關的機體組分、代謝改變及腦老化[10]。研究表明，AD患者血清中睪丸酮及雌二醇水平明顯降低[11]。Pierschmann 等[12]研究發現老年人 IL－2、IL－4及IL－13的水平會顯著增高。近年研究發現白介素(IL－1、IL－2、IL－6、TNF、TGF)等細胞因子在AD病灶區大量表達，不僅與神經元死亡及神經細胞凋亡密切相關，而且促進細胞黏附分子等的表達，在AD發病中發揮重要作用。本研究同樣發現AD小鼠體內Ach、雌二醇及ACTH的水平明顯減低，IL－2的水平明顯增高。

淫羊藿味辛甘性溫，補腎陽、益精氣，是常用的延年益壽藥物。現代研究表明，淫羊藿主要成分為淫羊藿總黃酮和淫羊藿多糖等[13]，具有抗衰老、保護心腦血管及增強免疫等藥理活性[14]。另外，其還具有較強雌激素活性[15]。女貞子味甘苦性涼，滋補肝腎、填髓益精。其具有抗炎、抗衰老、降血糖、降血脂、血管保護及提高免疫功能等藥理作用[16]。而淫羊藿與女貞子配伍，更使其平補陰陽、益腎填精的功效倍增。黃芪補心脾、益氣血。現代研究表明黃芪具有擴張血管、抗血栓、抗自由基、調節免疫等作用[17]。其能有效阻止大腦皮層和海馬區的神經軸突和突觸的消失;上調ACTH、皮質醇及升高 CD3+、CD4+、CD4+/CD8+細胞平均百分率水平;降低IL－2、IL－6、TNF－α和INF－γ的mRNA表達水平[18]。補骨脂味辛苦性溫，壯腰益腎。現代研究表明其可通過提高下丘腦－垂體－性腺軸的敏感性，從而影響血清中雌激素和睪丸酮含量，發揮雙向調節作用[19]。石菖蒲能夠化痰開竅、醒神益智。其內含的揮發油和細辛醚有較強抑制乙酰膽堿酯酶活性的作用[20]。川芎其味辛性溫，善通利血脈，芳香走竄，能升能降，善于上行頭目，入腦開閉，可使血行流利，腦絡通暢。其內含的川芎嗪易通過血腦屏障，可起到擴張腦血管、增加血流量的目的。本研究表明諸藥合用可升高AD小鼠體內Ach、雌二醇及ACTH的水平，降低IL－2的水平，從而起到調節NEI網絡平衡，防治AD疾患的作用;而安理申組僅Ach的水平可得到升高。表明中藥復方可通過整體多靶點作用于失穩的NEI網絡，達到防治AD的作用。

另外，本研究還發現，9月齡小鼠安理申組的Ach水平及同月齡益腎化濁方組的Ach、雌二醇、促腎上腺皮質激素及IL－2水平較同月齡安慰劑組變化差異有統計學意義(P≤0.001);12月齡月齡小鼠安理申組的Ach水平及同月齡益腎化濁方組的 Ach、雌二醇、ACTH及IL－2水平較同月齡安慰劑組變化差異有統計學意義(P＞0.001)。P值越小，代表差異越明顯。提示AD疾病的早期干預可能對其治療效果會產生更為明顯的作用。

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