過表達轉OsILP基因水稻株系的構建

孫偉清++張昌輪++袁茜++梁建生++呂冰

摘要：采用RT-PCR和TA克隆技術，從水稻品種日本晴中擴增出類整合素候選基因（integrin-like protein，ILP）OsILP的cDNA片段。經測序鑒定，克隆獲得的目的片段長為1 167 bp，包含完整的CDS，編碼388個氨基酸，預測分子量43 ku。進而將該片段連接至表達載體pTCK303中，通過PCR鑒定與酶切驗證，結果表明成功構建了pTCK303-OsILP過表達載體。并將表達載體質粒轉化為農桿菌EHA105，再通過農桿菌介導將其導入水稻日本晴的愈傷中，經遺傳轉化，陽性鑒定，獲得了過表達轉OsILP基因水稻株系。

關鍵詞：水稻；類整合素蛋白；過表達；轉基因株系

中圖分類號： Q785；S336文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2014）10-0017-04

收稿日期：2013-11-11

基金項目：江蘇省自然科學基金（編號：BK2009185）。

作者簡介：孫偉清（1987—），男，山東臨沂人，碩士，主要從事植物逆境生理研究。E-mail：qdswqlzc@163.com。

通信作者：呂冰，博士，副教授，主要從事植物生理生化與分子生物學研究。E-mail：lubing@yzu.edu.cn。水稻OsILP即Os03g0199100、LOC_Os03g10240，別稱UPF0496 protein 1，是由1 167個核苷酸序列編碼388個氨基酸組成的未知功能蛋白，預測分子量43 ku，屬于DUF677家族（domain of unknown function 677）。DUFs為具有保守結構域。但在Pfam等蛋白家族數據庫中信息較少、功能尚待明確的一系列蛋白家族[1]。其中，DUF677 （PF05055）家族是植物中存在的一個功能未知的蛋白家族。該家族中，除OsILP外，擬南芥AT14A也是其中之一。AT14A是一個與動物整合素蛋白具有部分相似序列和功能的膜蛋白[2-3]，被命名為類整合素蛋白（integrin like protein，ILP）。

整合素是動物細胞黏附分子的重要成員，屬于一類跨膜蛋白的超家族，是由2個跨膜糖蛋白亞基（α亞基、β亞基）通過非共價鍵連接而成的異二聚體[4]。從結構上看，α亞基、β亞基都是由1個大的N-胞外結構域、1個短的跨膜結構域、1個短的C-胞內結構域組成[5]。構成胞外結構域的氨基酸通過折疊和纏繞形成一個結合 “口袋”，能識別并結合各種含有RGD（Arg-Gly-Asp）短肽序列的胞外基質分子，并調節其與配體結合的特異性。跨膜結構域相對較小，但在進化上屬高度保守的區域。在胞質一側，整合素直接與包括α-輔肌動蛋白在內的多種肌動蛋白結合蛋白相連[6]。當細胞外因素刺激或細胞本身的生理功能發生變化時，α-輔肌動蛋白可通過其酪氨酸磷酸化、結合Ca2+或其他信號分子而影響細胞骨架形態，調節細胞運動。整合素作為黏附受體的生物學功能是傳導生化信號并改變細胞骨架的機械結構，從而構成了胞外基質（extracellular matrix，ECM）-質膜-細胞骨架連續體，成為動物細胞內外信號雙向轉導過程中的關鍵分子之一，在細胞的運動、增殖、分化、凋亡等方面起重要作用[7-9]。

序列比對結果表明，OsILP蛋白與擬南芥類整合素蛋白AT14A有22.87%的同源性，并且疏水氨基酸主要集中在 220～280 位氨基酸。預測蛋白結構（圖1）顯示，其與動物整合素亞基的構成更類似，即含有胞外結構域、跨膜結構域、胞內結構域各1個，且具有不同物種間較保守的同源序列，因此推測其為水稻中的類整合素（OsILP），參與了細胞內外信號轉導過程的調控。

本研究采用分子生物學技術克隆出OsILP，并構建過表達載體，再通過農桿菌介導法轉化水稻植株，獲得過表達的轉OsILP基因水稻株系，旨在為研究OsILP編碼蛋白的表達、定位及生理功能，最終判斷OsILP蛋白是否為水稻中的類整合素，以及研究其在細胞內外信號轉導中的作用奠定基礎。

1材料與方法

1.1供試材料

供試材料為粳稻品種日本晴（Oryza sativa subsp. japonica cv. Nipponbare）。克隆載體pMD19-T購自TaKaRa公司。pTCK303雙元載體由中國科學院種康實驗室惠贈。大腸桿菌（E.coli）DH5α、農桿菌（Agrobacterium tumefaciens）EHA105等分子生物學試驗常用菌種由筆者所在實驗室保存。

1.2OsILP基因擴增與T-A克隆

1.2.1引物設計根據GenBank公布的水稻基因及其登錄號NM_001055818在NCBI 數據庫中搜索OsILP基因的編碼序列，并結合表達載體（pTCK303）的多克隆酶切位點[10]（圖2）設計特異引物 （表1）。引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成，同時合成潮霉素（Hyg）抗性基因的引物。

1.2.2OsILP基因的PCR擴增提取日本晴水稻14 d幼苗的總RNA，以甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳和NanoDrop 2000 微量分光光度計檢測RNA 質量，參照TaKaRa公司的cDNA第一鏈合成試劑盒說明書，采用20 μL反應體系反轉錄合成水稻cDNA第一鏈。

以第一鏈cDNA為模板進行PCR 擴增，擴增條件：95 ℃預變性4 min；95 ℃變性30 s，63 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，30次循環；72 ℃后延伸10 min。

1.2.3OsILP基因的T-A克隆與測序純化的目的基因片段與pMD19-T載體連接，并轉化大腸桿菌DH5α 感受態細

表1目標基因的PCR擴增產物

基因引物序列（5′→3′）產物大小（bp）OsILPF：GGATCCATGGGGAACAGCAGCA；R：ACTAGTTCAGCTAGGATGCCGGATGA1 167HygF：CTTCTGCGGGCGATTTGTG；R：TGACTGGAGCGAGGCGATG300

胞。對所獲得的白斑菌落通過菌液PCR 擴增驗證后，按照上海捷瑞生物工程有限公司質粒小提試劑盒說明書提取質粒，并送至南京金斯瑞生物科技有限公司測序，以確定其是否為重組克隆載體pMD19-T-OsILP。

1.3過表達轉OsILP基因載體的構建與農桿菌的獲得

1.3.1OsILP基因過表達載體的構建將上述重組克隆載體（pMD19-T-OsILP）質粒和空載體pTCK303 質粒用限制性內切酶BamHⅠ和SpeⅠ 雙酶切，分別回收目標區域（1 200 bp 左右）片段和空載體酶切產物（約14 kb） 片段，用T4-DNA 連接酶過夜連接后轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞。

用2種方法分別驗證重組質粒：一是進行菌落PCR驗證；二是采用酶切驗證。PCR產物和酶切產物均用瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.3.2過表達轉OsILP基因農桿菌的獲得采用凍融法將重組質粒轉化到農桿菌EHA105感受態細胞中，對抗生素篩選出的陽性菌落以目的基因OsILP為目標產物進行PCR鑒定。

1.4過表達轉OsILP基因水稻株系的獲得與鑒定

水稻轉基因操作步驟參考劉巧泉等的方法[11]，略作改動。提取T0代轉化苗的葉片DNA，以潮霉素抗性基因為目標產物進行PCR擴增，擴增條件：95 ℃預變性4 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，30次循環；72 ℃后延伸10 min。

2結果與分析

2.1OsILP基因的克隆

將從日本晴水稻中提取的總RNA反轉錄成cDNA第一鏈后，進行OsILP基因的PCR擴增。瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物的結果如圖3-A所示，擴增產物大小為1 200 bp左右，符合目的片段1 167 bp預期。將回收并純化后的目標片段進行T-A克隆，菌液PCR驗證結果（圖3-B）表明，目的片段已轉入pMD19-T載體。陽性菌液測序結果經NCBI序列比對，與NCBI上報道的OsILP基因序列99%匹配，只有第1 040位上的堿基由 “T”變成“C”，即由“GAT”變成“GAC”，密碼子由“CUA”變成“CUG”，編碼同一種氨基酸（亮氨酸），此為同義改變。上述結果表明重組克隆載體 pMD19-T-OsILP 已構建成功。

2.2pTCK303-OsILP過表達載體的構建

利用位于載體pMD19-T-OsILP和表達載體pTCK303內含子兩端的BamHⅠ和SpeⅠ酶切位點，分別對提取的2個載體質粒進行雙酶切，回收各自目的片段（1 167、14 kb），將兩者用T4-DNA連接酶連接后轉化大腸桿菌DH5α。對菌液進行PCR鑒定，結果見圖4-A。除陰性對照外，陽性對照和檢測菌液均可以擴增出1 167 bp長的目的片段。進而提取質粒，對重組質粒進行雙酶切鑒定（圖4-B），1號泳道為空載體的酶切結果，在400 bp處可看到1條帶，為內含子片段；2號泳道為重組載體的酶切結果，在1 200 bp左右處出現1條帶，說明目標片段（1 167 bp）已正確連接到pTCK303載體中。

將所構建的過表達載體pTCK303-OsILP導入農桿菌EHA105中，農桿菌菌液PCR檢測如圖4-C所示，1號泳道為空載體陰性對照，2號泳道為陽性對照，3～5號泳道為不同的單克隆菌株，2～5號泳道均擴增出目的片段，說明過表達載體pTCK303-OsILP已成功導入農桿菌EHA105，可以進行下一步的愈傷轉化。

2.3農桿菌介導的水稻遺傳轉化

以成熟胚愈傷組織為材料，與轉過表達載體pTCK303-OsILP的農桿菌菌液共培養后，用含潮霉素、頭孢霉素的培養基進行抗性篩選，得到抗性愈傷（圖5-A），并對篩選出的抗性愈傷誘導生芽（圖5-B），再將生芽植株轉移至生根培養基培養生根（圖5-C），獲得再生抗性苗，然后移栽到盆缽（圖5-D）。

2.4T0代過表達轉OsILP基因水稻植株的潮霉素抗性基因檢測

提取再生苗葉片基因組DNA，以潮霉素抗性基因為特異擴增對象進行PCR擴增。由圖6可見，在檢測的9株再生苗中有6株能擴增出預期長度的目標條帶，即檢測出了潮霉素抗性基因，證實帶有嵌合基因的T-DNA區域已融合到水稻植株的基因組中，獲得了陽性轉基因植株。

3結論與討論

采用反向遺傳學技術，首先從水稻cDNA文庫中擴增出了OsILP基因編碼區全長序列。由于OsILP基因序列GC含量高達60%以上，使得引物的退火溫度變高，普通Taq酶無法擴增出完整的目的基因全長，只能得到500～800 bp的片段。本研究采用TaKaRa公司的 LA Taq with GC Buffer Ⅰ（編碼RR02AG），應用LA PCR原理研制出具有3′→5′Exonuclease活性 （Proof reading活性） 的耐熱性DNA聚合酶。無論是擴增短鏈DNA還是長鏈DNA，其效率都優于其他同類產品，尤其是在擴增大于10 kb的DNA片段上，其優勢更加明顯，而且保真性能強。當擴增具有復雜的二級結構 （GC rich等） 的模板或重復序列的模板時，使用GC Buffer進行PCR擴增將非常有效。然而該酶雖能完整擴增出目的片段，但并不能保證測序結果與目的片段完全一致，多次試驗結果均不理想，最好的試驗結果是本研究中達到的99%匹配率，因是同義突變，沒有改變氨基酸序列，編碼蛋白與目標蛋白完全一致。

pTCK303雙元表達載體是構建RNA干擾載體，使基因沉默的常用載體[10]。因其在內含子兩端各自反向連入了1段目的基因，使之在轉錄后能形成雙鏈RNA（dsRNA）。dsRNA 首先與Dicer酶的dsRNA結合區結合，并降解成為21～23個核苷酸的小分子干擾RNA（siRNA）。siRNA在解旋酶的作用下解鏈形成的反義鏈RNA可指導生成一種核蛋白體復合物，也叫誘導沉默復合體（RISC），在解旋酶作用下，雙鏈RNA解鏈形成單鏈，RISC的內切酶及外切酶活性被激活，在 siRNA序列的引導下，對靶mRNA進行剪切，從而降解特定mRNA，從而使目標基因沉默[12-15]。而本研究直接利用目的基因全長替換掉載體上的內含子片段，使之成為過表達載體。

將構建的過表達載體導入農桿菌EHA105，再通過根癌

農桿菌介導的方法轉化水稻愈傷。具體操作時鑒于農桿菌生長不容易控制，建議浸染后的愈傷組織一定要盡量吹干再移到共培養基，并且一定要在培養基里墊1層無菌濾紙，即使這樣，在后面篩選培養基中仍須加一定濃度的頭孢霉素，以防止農桿菌過度繁殖。初步篩選僅有小部分能正常生長出嫩黃色的新生愈傷組織。第2步篩選時，潮霉素濃度加倍，而頭孢霉素的濃度相應降低，此時大部分愈傷組織都能正常生長，只是極個別愈傷仍會大量繁殖農桿菌，最后獲得9株轉基因再生苗。

T0代轉基因植株的鑒定主要是以載體上的潮霉素基因為擴增對象，初步鑒定獲得了6個過表達的轉基因水稻植株，這為研究OsILP蛋白的表達、定位及生理功能，最終判斷其是否即為水稻中的類整合素，以及研究OsILP在細胞內外信號轉導中的作用奠定了基礎。

4研究展望

生物信息學研究表明，OsILP的表達情況與生物脅迫、非生物脅迫、種子萌發均有關系。不僅如此，基因芯片數據庫結果還顯示，OsILP在水稻不同器官組織中的表達情況也各不相同，尤其在胚乳等貯藏器官中OsILP的表達量相對較高，而在葉片等營養器官中表達量相對較低。因此，OsILP的功能可能與水稻抗逆、種子萌發、籽粒胚乳發育密切相關。

OsILP是用擬南芥類整合素基因AT14A序列在水稻數據庫中BLAST尋找的基因，兩者的編碼蛋白同屬DUF677家族。筆者所在實驗室已有研究表明，AT14A作為擬南芥中的類整合素，介導了細胞壁-質膜-細胞骨架連續體，在細胞的內外信號轉導方面起著重要作用[3]。從結構上來看，水稻OsILP含有胞外結構域、跨膜結構域、胞內結構域各1個，其分子結構與動物整合素更為類似。結構相似提示功能可能一致，OsILP是否為水稻中的類整合素及其與水稻種子發育、萌發及響應逆境脅迫的關系，還須進一步驗證。

參考文獻：

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將構建的過表達載體導入農桿菌EHA105，再通過根癌

農桿菌介導的方法轉化水稻愈傷。具體操作時鑒于農桿菌生長不容易控制，建議浸染后的愈傷組織一定要盡量吹干再移到共培養基，并且一定要在培養基里墊1層無菌濾紙，即使這樣，在后面篩選培養基中仍須加一定濃度的頭孢霉素，以防止農桿菌過度繁殖。初步篩選僅有小部分能正常生長出嫩黃色的新生愈傷組織。第2步篩選時，潮霉素濃度加倍，而頭孢霉素的濃度相應降低，此時大部分愈傷組織都能正常生長，只是極個別愈傷仍會大量繁殖農桿菌，最后獲得9株轉基因再生苗。

T0代轉基因植株的鑒定主要是以載體上的潮霉素基因為擴增對象，初步鑒定獲得了6個過表達的轉基因水稻植株，這為研究OsILP蛋白的表達、定位及生理功能，最終判斷其是否即為水稻中的類整合素，以及研究OsILP在細胞內外信號轉導中的作用奠定了基礎。

4研究展望

生物信息學研究表明，OsILP的表達情況與生物脅迫、非生物脅迫、種子萌發均有關系。不僅如此，基因芯片數據庫結果還顯示，OsILP在水稻不同器官組織中的表達情況也各不相同，尤其在胚乳等貯藏器官中OsILP的表達量相對較高，而在葉片等營養器官中表達量相對較低。因此，OsILP的功能可能與水稻抗逆、種子萌發、籽粒胚乳發育密切相關。

OsILP是用擬南芥類整合素基因AT14A序列在水稻數據庫中BLAST尋找的基因，兩者的編碼蛋白同屬DUF677家族。筆者所在實驗室已有研究表明，AT14A作為擬南芥中的類整合素，介導了細胞壁-質膜-細胞骨架連續體，在細胞的內外信號轉導方面起著重要作用[3]。從結構上來看，水稻OsILP含有胞外結構域、跨膜結構域、胞內結構域各1個，其分子結構與動物整合素更為類似。結構相似提示功能可能一致，OsILP是否為水稻中的類整合素及其與水稻種子發育、萌發及響應逆境脅迫的關系，還須進一步驗證。

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將構建的過表達載體導入農桿菌EHA105，再通過根癌

農桿菌介導的方法轉化水稻愈傷。具體操作時鑒于農桿菌生長不容易控制，建議浸染后的愈傷組織一定要盡量吹干再移到共培養基，并且一定要在培養基里墊1層無菌濾紙，即使這樣，在后面篩選培養基中仍須加一定濃度的頭孢霉素，以防止農桿菌過度繁殖。初步篩選僅有小部分能正常生長出嫩黃色的新生愈傷組織。第2步篩選時，潮霉素濃度加倍，而頭孢霉素的濃度相應降低，此時大部分愈傷組織都能正常生長，只是極個別愈傷仍會大量繁殖農桿菌，最后獲得9株轉基因再生苗。

T0代轉基因植株的鑒定主要是以載體上的潮霉素基因為擴增對象，初步鑒定獲得了6個過表達的轉基因水稻植株，這為研究OsILP蛋白的表達、定位及生理功能，最終判斷其是否即為水稻中的類整合素，以及研究OsILP在細胞內外信號轉導中的作用奠定了基礎。

4研究展望

生物信息學研究表明，OsILP的表達情況與生物脅迫、非生物脅迫、種子萌發均有關系。不僅如此，基因芯片數據庫結果還顯示，OsILP在水稻不同器官組織中的表達情況也各不相同，尤其在胚乳等貯藏器官中OsILP的表達量相對較高，而在葉片等營養器官中表達量相對較低。因此，OsILP的功能可能與水稻抗逆、種子萌發、籽粒胚乳發育密切相關。

OsILP是用擬南芥類整合素基因AT14A序列在水稻數據庫中BLAST尋找的基因，兩者的編碼蛋白同屬DUF677家族。筆者所在實驗室已有研究表明，AT14A作為擬南芥中的類整合素，介導了細胞壁-質膜-細胞骨架連續體，在細胞的內外信號轉導方面起著重要作用[3]。從結構上來看，水稻OsILP含有胞外結構域、跨膜結構域、胞內結構域各1個，其分子結構與動物整合素更為類似。結構相似提示功能可能一致，OsILP是否為水稻中的類整合素及其與水稻種子發育、萌發及響應逆境脅迫的關系，還須進一步驗證。

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