遼寧千山地區含cry8類基因的蘇云金芽孢桿菌的分離、克隆與表達

孫鈺航++劉艷杰++李海濤++高繼國

摘要：QWH132、QZL1-2、QWH 7-2、QZL144-1、QZL144-2、QWH101是筆者所在實驗室從遼寧千山地區自行分離的含有cry8類基因的蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis），具有鞘翅目殺蟲活性。本研究在6株菌株中成功發現并克隆了6個靶標生物為鞘翅目的cry8類基因，其中被鑒定為cry8C類、cry8D類、cry8F類（大小為3 525 bp）、cry8K類的基因各有1個，被鑒定為cry8E類的基因有2個，其大小分別為3 534、3 495 bp。后4個基因已在GenBank注冊，登記號依次為KC778983、KC778983、KC778984、KC778985。將6個基因插入pEB表達載體，經過PCR檢測與 SDS-PAGE 分析證實它們能在大腸桿菌中進行異源表達，這6個基因的表達約有126～128 ku的蛋白，這些菌株中的Cry8蛋白為進一步發掘我國天然的蘇云金芽孢桿菌資源與構建新的殺鞘翅目昆蟲的高效工程菌提供了重要的試驗材料與新思路。

關鍵詞：蘇云金芽孢桿菌；大腸桿菌；質粒；cry8基因；克隆；表達；生物信息學分析

中圖分類號：Q785文獻標志碼：A文章編號：1002-1302（2014）10-0028-04

收稿日期：2014-01-07

基金項目：國家“863”計劃（編號：2011AA10A203、2010RCB54）。

作者簡介：孫鈺航（1984—），男，黑龍江牡丹人，碩士研究生，研究方向為生物化學與分子生物學。E-mail：weiweiabcd222@163.com。

通信作者：高繼國，教授，博士生導師，研究方向為生物化學與分子生物學。E-mail：gaojiguo1961@hotmail.com。蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis，簡稱Bt）是目前應用最多也是應用最廣泛的生物殺蟲劑。它是天然的昆蟲病原菌，對無脊椎動物中的4個門（包括節肢動物門中的16個目的3 000種以上）的害蟲有活性[1]，而對非目標生物安全，從而廣泛用于防治鱗翅目（Lepidoptera）、雙翅目（Diptera）、鞘翅目（Coleoptera）等農林害蟲[2]。蘇云金芽孢桿菌能夠產生多種殺蟲活性物質，其中主要有Cry蛋白、Vip蛋白、Sip蛋白，其中對Cry蛋白與Vip蛋白的研究較深入[3]。隨著研究與應用的深入，Bt殺蟲基因在殺蟲工程菌和轉基因抗蟲植物廣泛應用的過程中已發現多種昆蟲在實驗室條件下對Bt毒素產生抗性，在田間也發現了具有抗性的個體[4]，因此，篩選、克隆新的高毒力、殺蟲譜廣且不易產生抗性與交互抗性的基因是解決問題的重要途徑之一[5]。Cry8類蛋白質在Bt中分布比較廣泛，它們對金龜子科、象甲科、葉甲科等多種鞘翅目害蟲具有殺滅作用[6]。但目前成功防治鞘翅目害蟲的Bt菌株和產品數量還相對較少，鞘翅目害蟲是糧食作物、經濟作物、園藝和森林的重要害蟲，因此分離新的對鞘翅目害蟲具有較高殺滅效果的Bt菌株并研究其殺蟲蛋白基因，對于開發高效安全的生物殺蟲劑和生產轉基因作物有重要的理論和實踐意義[7]。近些年發現的Bt殺蟲活性物質另外一種Sip蛋白也具有鞘翅目害蟲活性，Sip蛋白的發現為Bt殺蟲活性蛋白提供了一條新思路[8]。筆者所在實驗室自行分離出QWH132、QZL1-2、QWH7-2、QZL144-1、QZL144-2、QWH101菌株，經鑒定這些菌株中含有cry8類具有鞘翅目殺蟲活性的基因。本研究以這些菌株為模板，分離克隆菌株中的cry8C、cry8D、cry8E、cry8F、cry8K基因，并對其中所含的cry8類基因進行克隆與表達。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株來源本試驗所用菌株分離自遼寧千山采集的土樣，采用醋酸鈉-抗生素篩選法進行分離[9]。其余菌株質粒見表1。

1.1.2酶及生化試劑2×Taq mix、2 × Primer Star mix均購自TaKaRa公司；質粒提取試劑盒、DNA膠回收試劑盒購自美國Axygen公司；其他均為市售國產或進口分析純或電泳級純化學試劑。

1.1.3主要儀器主要儀器包括Labnet PCR儀[Multigene Gradient（TC9600-G-230V）]、蛋白電泳儀（BIO-RAD MiNi-PROTEAN Tetra system）、離心機Beckman（AllegraTM64R Centrifuge）、北京賽智創業科技有限公司生產的ChampGel 6000全自動凝膠成像系統Gel Documentation And Image Analysis System等。

1.1.4培養基與抗生素液體LB：蛋白胨 10.0 g，酵母粉5.0 g，NaCl 10.0 g，加水定容到1 000 mL，調pH 值為70；固體LB：在液體培養基中加入1.3%瓊脂。1/2固體LB：蛋白胨5.0 g，酵母粉2.5 g，NaCl 5.0 g，加水定容至1 000 mL，加入1.3%瓊脂，調pH值至7.0；將氨芐青霉素、卡那霉素配制成100 mg/mL的水溶液，經0.22 μm過濾器過濾除菌，-20 ℃ 保存。

1.2方法

1.2.1從土壤中分離Bt菌Bt菌株分離純化的方法參照文獻[10]。表1菌株與質粒

菌株質粒特點描述來源大腸桿菌

（Escherichia coli）Rosetta

F-ompT hsdSB （RB-mB-） gal dcm λ（DE3[lacI lacUV5-T7 gene 1 ind1 sam7 nin5]） pLysSRARE（CamR）筆者所在實驗室

JM109

rpsL（strr）、thr、leu、thi-1、lacY、galK、galT、ara、tonA、tsx、dam、dcm、supE44、Δ（lac-proAB）、[F′，traD36，proAB，laclqZΔM15]筆者所在實驗室蘇云金芽孢桿菌QWH132筆者所在實驗室QZL1-2筆者所在實驗室QWH 7-2筆者所在實驗室QZL144-1筆者所在實驗室QZL144-2筆者所在實驗室QWH101筆者所在實驗室PlasmidspMD19-T VectorAmprTaKaRa公司pEB