荷花ISSR引物篩選及反應體系優化

徐君等

摘要：利用加拿大哥倫比亞大學（UBC）公布的100條ISSR引物，以2個荷花品種的DNA為模板進行PCR擴增。采用單因素試驗方法對荷花ISSR-PCR反應體系的5個因素（Mg2+、引物、dNTP、模板DNA、Taq酶）進行濃度優化，確定了荷花ISSR反應的25 μL最佳擴增體系為：10×Taq Buffer 2.5 μL，Mg2+ 3.0 mmol/L，dNTP 0.2 mmol/L，引物 1.0 μmol/L，Taq酶 1.00 U，模板DNA 40 ng。篩選出8條擴增條帶較好的ISSR引物，并對其引物進行梯度PCR試驗，篩選出各引物對應的最佳退火溫度，擴增共計獲得61條ISSR條帶。

關鍵詞：荷花；ISSR 引物篩選；體系優化

中圖分類號： S682.320.1文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2014）10-0042-03

收稿日期：2013-12-09

基金項目：江蘇省農業科技自主創新資金[編號：CX（12）5075]。

作者簡介：徐君（1982—），男，江蘇蘇州人，碩士，助理研究員，主要從事植物細胞工程研究。Tel：（0512）65386213；E-mail：flyforever007@163.com。

通信作者：姜紅衛，副研究員，主要從事觀賞園藝研究。Tel：（0512）65389221；E-mail：sacjhw@163.com。荷花（Nelumbo nucifera）是我國的十大名花之一，具有較高的觀賞價值、經濟價值，在食用、藥用、園林綠化以及外貿出口等方面有很大的開發潛力[1]。我國是荷花的原產地之一，荷花品種資源十分豐富，近年來，育種工作者利用資源優勢，采用自然雜交與人工雜交的方法，育成了大量的荷花新品種。目前，我國記載收編的荷花品種已超過800個。《中國荷花新品種圖志》按照植物二元分類法，以種系、株型、花型、花色為分類標準，將荷花分為3系6群16類48型[2]。由于荷花品種數量多、種間差異小、親緣關系較近，單純利用少數性狀進行定性描述很難闡明荷花品種間的親緣關系[3]。因此，應采用表型與多態性高、穩定性佳的分子標記技術相結合的方法對荷花種質資源進行研究。ISSR技術在獲得大量位點信息的同時，兼具操作簡單、快捷、DNA 用量少、技術要求低、成本低以及引物設計無需了解基因組序列等特點，與RFLP、RAPD技術相比，ISSR技術的重復性、穩定性較高[4-6]。目前，ISSR分子標記技術被廣泛應用于遺傳多樣性分析、遺傳作圖、系統進化關系等領域[7-10]。ISSR技術也存在缺陷，由于各引物間AT、CG比例差異很大，特異退火溫度各不相同，如未開展預備試驗，將會對試驗結果造成不可預計的影響[11]。因此，為獲得清晰、可靠、準確的數據，在開展ISSR試驗前，進行反應體系優化十分必要。江蘇太湖地區農業科學研究所自2010年開始，對太湖地區的荷花資源進行收集、保存、種質鑒定，并進行了大量的相關育種工作。對資源進行鑒定是資源利用的基礎，應當采用表型分析結合分子標記分析方法，對所收集的荷花資源的遺傳多樣性進行評價。本研究優化荷花ISSR最佳反應體系，篩選最佳引物，為保證ISSR擴增結果清晰、可靠、準確，根據特定的ISSR引物設計最佳退火溫度，旨在為將ISSR技術應用于荷花種質資源研究奠定基礎。

1材料與方法

1.1材料

荷花取自江蘇省蘇州市荷塘月色濕地公園蘇州市農業科學院荷花資源保存圃，參試品種包括白千葉、太湖紅蓮2種。DNA Marker、PCR試劑盒等相關試劑購自生工生物工程（上海）股份有限公司。100條ISSR引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2方法

1.2.1荷花取樣及基因組DNA提取2013年6—7月進行取樣，盡量采剛長出的幼葉，取樣時采用0.5 cm打孔器于每葉四周、中部各打1孔，每品種取3葉，直接放入離心管中，置于 -70 ℃ 下備用。采用改良的CTAB法[12-13]提取荷花基因組DNA。用1%瓊脂糖凝膠電泳初步檢測DNA質量，通過紫外線分光光度計測定260、280 nm處的吸光度值，檢測DNA的質量、濃度，提取原液置于-20 ℃保存，將用于PCR反應的DNA工作液進一步稀釋至100 ng/μL備用。

1.2.2荷花ISSR反應體系優化選擇預備試驗中擴增效果較好的引物807，對荷花基因組DNA進行ISSR擴增。擴增程序：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火 45 s，72 ℃ 延伸1 min，35個循環；72 ℃延伸10 min；4 ℃ 終止反應。反應總體積為25 μL，10×Taq Buffer 2.5 μL，Mg2+濃度分別設為1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mmol/L，dNTP濃度分別設為01、02、0.3、0.4、0.5 mmol/L，引物濃度分別設為02、04、06、0.8、1.0 μmol/L，Taq酶用量分別設為0.25、050、075、100、1.25 U，模板DNA濃度分別為20、40、60、80、100 ng，用滅菌雙蒸水補足。擴增產物用1%瓊脂糖凝膠電泳分離，紫外光下UV凝膠成像系統觀察結果，篩選出最佳的反應體系。

1.2.3荷花ISSR引物篩選與梯度PCR反應程序從100條ISSR引物中篩選出擴增結果較好的8條引物用于PCR擴增，擴增體系參照“1.2.2”節。PCR擴增程序為：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，50～60 ℃（2 ℃/梯度，共6個梯度）退火45 s，72 ℃延伸1 min，35個循環；72 ℃延伸10 min；4 ℃ 終止反應。電泳及凝膠觀察方法同“1.2.2”節，篩選出各引物的最佳退火溫度。

2結果與分析

2.1基因組DNA提取與檢測

檢測同一批提取的 DNA 樣品，結果表明，主帶明亮，略有拖尾現象，說明CTAB DNA快速提取法效果好，但存在少許DNA降解現象（圖1）。

2.2各因素水平對ISSR擴增反應的影響

選用白千葉、太湖紅蓮，檢驗Mg2+濃度、dNTP濃度、Primer濃度、Taq酶、模板DNA濃度各因素對ISSR擴增反應的影響，結果如圖2所示。

2.2.1Mg2+濃度對ISSR-PCR的影響由圖2-a可知，當Mg2+濃度超過1.5 mmol/L時，大部分擴增條帶亮度較好，特異性較強；Mg2+濃度較高時易與dNTP、引物、模板結合，影響模板與引物的結合率，產生非特異性，出現彌散的帶。本試驗中，當Mg2+濃度小于3.5 mmol/L時，并未出現以上現象；當Mg2+濃度為1.5～3.5 mmol/L時，條帶無顯著差異，清晰明亮，說明以上濃度均適宜荷花ISSR反應，在實際反應中Mg2+濃度采用3.0 mmol/L。

2.2.2dNTP 濃度對 ISSR-PCR 的影響dNTP濃度過低會導致產率下降，條帶亮度不足。由圖2-b可知，當dNTP濃度為0.1 mmol/L時；條帶很亮；當dNTP濃度大于0.2 mmol/L時，產生了錯配現象，形成了2條非特異條帶。綜合考慮各方面因素，實際反應中dNTP濃度采用0.1 mmol/L。

2.2.3引物濃度對 ISSR-PCR 的影響由圖2-c可知，引物濃度過高易形成引物二聚體，影響PCR擴增。因此實際操作中應避免選擇過高的引物濃度，綜合考慮各方面因素，實際反應中引物濃度采用1.0 μmol/L。

2.2.4模板 DNA濃度對 ISSR-PCR 的影響由圖2-d可知，模板 DNA濃度對 ISSR-PCR影響不大，當模板DNA總量達100 ng時，擴增條帶偏暗，說明模板DNA濃度過高會抑制擴增結果，綜合考慮各方面因素，實際反應中采用25 μL反應體系加入40 ng模板DNA。

2.2.5Taq酶濃度對 ISSR-PCR 結果的影響由圖2-e可知，當Taq酶用量小于1.0 U時條帶相對較暗，當用量為 1.25 U 時條帶開始彌散，因此實際操作中Taq酶濃度過低或者過高都不可取，實際反應中采用25 μL反應體系加入1 U TaqDNA聚合酶。

2.2.6荷花ISSR擴增最優化體系經上述試驗，荷花ISSR擴增建立25 μL反應體系（表1）。

表1荷花ISSR優化體系

成分最終濃度/使用量加入量（μL）10×Taq 酶1×2.5 25 mmol/L Mg2+3.0 mmol/L3.0 2 mmol/L dNTP0.2 mmol/L2.5 25 μmol/L Primer1.0 μmol/L1.0 5 U/μL Taq酶1.00 U0.2 25 ng/μL模板DNA40 ng1.0 滅菌 ddH2O14.8

2.3荷花ISSR引物篩選及退火溫度對各引物擴增的影響

2.3.1荷花ISSR引物的篩選結果選取白千葉、太湖紅蓮2個荷花品種，以基因組DNA為模板，分別對加拿大哥倫比亞大學（UBC）所設計的100條引物，按照“2.2”所述最佳反應條件及體系進行PCR擴增，篩選出37條有條帶的引物。比對2個品種的擴增結果，選擇了8個荷花ISSR擴增最佳引物，具體引物編號及序列如表2所示。

2.3.2退火溫度對ISSR引物擴增的影響8個ISSR引物用6個退火溫度進行擴增，結果表明，所有引物均出現不同退火溫度擴增帶型差異的情況。選擇各引物擴增重復性好、擴增條帶清晰的退火溫度為最佳退火溫度，退火溫度與合成報告單上的Tm趨勢有關，但不完全一致。各引物的最佳退火溫度如表2所示，8個引物共擴增出61條條帶（圖3）。

表28個荷花ISSR引物序列及各引物的最佳退火溫度

引物編號引物序列

（5′→3′）最佳退火溫度

（℃）ISSR帶數

（條）807（AG）8T585808（AG）8C589836（AG）8YA6010840（AG）8YT608842（GA）8YG6011845（CT）8RG585846（CA）8RT586848（CA）8RG587

3結論與討論

ISSR分子標記受多種因素的影響，雖然ISSR較RAPD、RFLP等第一代標記穩定，但是試驗的可靠性、穩定性仍然與PCR反應條件有很大關系[14-15]。PCR體系中的Taq酶濃度、Mg2+濃度、引物濃度、dNTP濃度、模板DNA濃度均為重要反應條件。本試驗表明，荷花ISSR反應中各試劑在較廣的濃度范圍均可得到較好的擴增結果，荷花ISSR反應25 μL擴增體系：10×Taq Buffer 2.5μL，Mg2+ 3.0 mmol/L，dNTP 0.2 mmol/L，引物1.0 μmol/L，Taq酶 1.0 U，模板DNA 40 ng。本研究篩選了加拿大哥倫比亞大學（UBC） 公布的100條引物，從中篩出8條擴增出穩定、較亮條帶的引物專門用于荷花遺傳多樣性鑒定。本試驗顯示，退火溫度是荷花 ISSR 成功與否的決定性因素，退火溫度過低，會引起錯配，產生非特異條帶，嚴重影響試驗結果的準確性；退火溫度過高，會干擾模板與引物結合，降低擴增產量，嚴重影響讀帶。本研究篩選的所有引物均出現退火溫度不同、擴增帶型不同的情況，因此，ISSR擴增前應當通過梯度PCR，精確確定所篩選的 ISSR 引物對應于荷花基因組DNA擴增的最適退火溫度。本研究篩選的8個ISSR引物為807、808、836、840、842、845、846、848，結合優化的PCR體系、最佳的特定引物退火溫度，可擴增61條ISSR條帶，ISSR擴增結果較好。荷花ISSR-PCR技術成本低廉、操作簡便、可靠性高，能提供大量遺傳信息，可用于大量鑒定荷花種質資源。

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