蘋果M7砧木組織培養與抗性篩選

段艷欣

摘要：以M7組培苗為試驗材料，進行繼代擴繁和卡那霉素抗性篩選研究。結果表明，M7芽苗在MS+4.0 mg/L 6-BA+0.3 mg/L IBA（3%蔗糖）固體培養基中繼代時，出現嚴重的玻璃化，而MS+1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA（3%蔗糖）固體培養基可大大改善其玻璃化程度，使其恢復健康生長；卡那霉素對M7葉片再生、新梢增殖、新梢生根均有抑制作用，并且隨卡那霉素濃度增加，M7葉片再生率、新梢增殖率、新梢生根率不斷下降；M7葉片愈傷組織形成、愈傷組織生根、新梢增殖及新梢生根對卡那霉素的敏感濃度分別為20、5、40、10 mg/L。

關鍵詞：蘋果M7砧木；組織培養；玻璃化；抗性篩選

中圖分類號： S661.104.+3；Q813.1+2文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2014）10-0052-02

蘋果（Malus pumila Mill）M7是薔薇科蘋果屬植物，為蘋果的半矮化砧木，與蘋果嫁接親和力強，其根系發達，較抗旱、抗寒，耐瘠薄，適應性很強。轉基因安全性一直是人們關心的熱點，而對蘋果砧木的遺傳改良比對品種的改良更具有可操作性。卡那霉素抗性基因即新霉素磷酸轉移酶基因（nptⅡ）是目前在植物基因轉化中應用最廣泛的選擇標記基因[1]。前人研究表明，不同外植體或同一外植體不同發育階段對卡那霉素的敏感性不一樣[2]，因此在進行遺傳轉化之前，首先要確定外植體對卡那霉素的敏感性濃度[3]。本試驗以蘋果M7砧木組培苗為試驗材料，研究其在繼代擴繁過程中的生長情況，并分別在葉片再生、新梢增殖、生根等方面進行了卡那霉素敏感試驗，以期為后期的遺傳轉化奠定基礎。

1材料與方法

1.1材料與試劑

以蘋果M7砧木組培苗為試驗材料，由筆者所在實驗室保存，選取生長健壯、帶2～3張葉的芽為外植體。試驗用卡那霉素為醫藥級，購自美國Sigma公司；其他試劑為分析純。

1.2試驗方法

1.2.1M7苗的繼代增殖培養選取生長健壯的M7組培苗，接種在繼代增殖培養基內，培養基配方為：MS+4.0 mg/L 6-BA+0.3 mg/L IBA，每瓶接4個新芽，每個處理接5瓶，重復3次。培養30 d后統計芽的增殖與生長情況。在使用上述增殖培養基繼代時，發現大部分芽出現玻璃化，將玻璃化的芽單獨切下，改用MS+1.0 mg/L 6-BA+ 0.1 mg/L NAA培養基培養，15 d后觀察芽苗的生長情況。

1.2.2M7葉片再生過程對卡那霉素的敏感性選取組培苗頂部幼嫩、生長健壯、平展的葉片，葉片大小、形狀和色澤基本一致，將葉片用接種刀橫切幾刀，葉背朝上平鋪在加有不同濃度（0、5、10、20 mg/L）卡那霉素的葉片再生培養基上[4]，培養基配方為：MS+4.0 mg/L 6-BA+0.3 mg/L IBA，暗培養14 d后轉移至光照下培養20 d后，觀察葉片長愈傷組織或長芽情況。接種量10張葉片/皿，3皿/處理，2次重復。

1.2.3M7新梢增殖對卡那霉素的敏感性試驗將長度約 2 cm 的組培芽（新梢）分別接種于加有不同濃度（0、10、20、40 mg/L）卡那霉素的新梢擴繁培養基（MS+1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA）中，于光照下培養1個月后統計結果。接種量4個芽/瓶，5瓶/處理，重復2次。

1.2.4M7新梢生根對卡那霉素的敏感性試驗將長度約 2 cm （帶有2～3張葉）的組培芽（新梢）分別接種于加有不同濃度（0、5、10、20 mg/L）卡那霉素生根培養基中（1/2MS+1.0 mg/L IBA），于光照下培養20～30 d后統計結果。接種量3個芽/瓶，4瓶/處理，重復2次。

1.3培養條件

芽增殖與生根培養在光照培養室內進行，培養條件為：溫度為（25±2） ℃，光照強度為2 000 lx，光照時間為12 h/d。葉片再生試驗的暗培養是在恒溫箱中進行的，培養溫度 24 ℃。培養基為基本培養基，附加蔗糖30 g/L、瓊脂8 g/L，pH值5.8，將配制好的培養基在121 ℃下滅菌20 min備用。

2結果與分析

2.1M7組培苗的增殖與玻璃化苗的改善

取生長健壯的M7組培苗，莖段部分帶3～4張嫩葉，轉移至繼代擴繁培養基中（圖 1-A）；于光下培養20 d左右，發現長出大量不定芽，培養30 d時，部分不定芽表現正常（圖1-B），部分不定芽的嫩莖、葉片呈半透明水漬狀（圖1-C），即玻璃化，此類芽生長緩慢，繁殖系數低，不利于保存與再利用；改變培養基配方后，其玻璃化現象得到了較大改善，芽與葉片呈綠色，恢復生長（圖1-D）。

2.2M7葉片再生過程對卡那霉素的敏感性

在M7葉片再生過程中，添加不同濃度卡那霉素后，葉片再生情況為：沒有添加卡那霉素的培養基葉片形成愈傷組織率高達100%，之后從愈傷組織處生根（圖2-A、圖2-B）；當卡那霉素濃度為5 mg/L時，葉片出愈率為60%，愈傷組織

不能分化出根（圖2-C）；卡那霉素濃度升高至10 mg/L時的出愈率僅為10%，卡那霉素濃度為20 mg/L時，無愈傷組織形成（圖2-D），這2個濃度下均沒有根分化。

2.3M7新梢增殖對卡那霉素的敏感性

由表1可見，M7新梢芽增殖倍數隨卡那霉素濃度增大而減少直至無增殖甚至死亡。卡那霉素濃度為0 mg/L時，芽增殖率100%，并且芽生長健壯，正常綠色；濃度為10 mg/L時，芽增殖倍數為2.5，比對照約下降68%，且再生芽黃綠色，生長勢弱；濃度為20 mg/L時，芽增殖率下降到對照的5%左右，芽黃綠色，幾乎不生長；當卡那霉素濃度為40 mg/L，新梢沒有增殖，說明該濃度可以完全抑制M7新梢的增殖。

2.4M7新梢生根對卡那霉素敏感性

由表2看出，M7新梢生根數隨卡那霉素濃度的升高而明顯下降，且芽苗不斷變黃甚至白化死亡。卡那霉素濃度為 0 mg/L時，芽苗生根率100%（圖3-A），平均每棵苗生根數為2～3條，并且根生長粗壯，白色，生長較快；卡那霉素濃度為5 mg/L時，生根率10%，根白色，生長明顯減慢；卡那霉素濃度為10 mg/L時，新梢不能生根（圖3-B），可見 ≥10 mg/L 卡那霉素可以完全抑制M7芽苗的生根。

表1卡那霉素對M7新梢增殖的影響

卡那霉素濃度

（mg/L）接種芽數

（個）芽再生情況芽增殖倍數芽生長狀況（健壯與否）0407.8綠色，健壯10402.5黃綠色，生長較弱20400.4黃綠色，幾乎不生長40400無

表2卡那霉素對M7新梢生根的影響

卡那霉素濃度

（mg/L）接種芽數

（個）生根數量

（條）根生長情況01235白色，健壯，生長較快5122白色，生長較慢10120無20120無

3小結與討論

玻璃化現象是一種生理病態現象，也是蘋果莖尖培養時

經常遇到的問題，發生玻璃化的材料呈半透明水漬狀，生長緩慢、繁殖系數低，偶爾可在延長培養期間恢復正常生長，但通常比率很低。導致這種現象的原因，張洪勝等認為是培養環境中的某種脅迫條件誘導產生應激乙烯，乙烯的直接或間接作用引起玻璃化的發生[5]；也有研究表明，改變培養時的濕度、瓊脂濃度、細胞分裂素濃度等均可有效地預防和緩解玻璃苗的發生[6]。本試驗中，采用4.0 mg/L 6-BA與0.3 mg/L IBA組合，雖然可以誘導M7大量增殖，但容易導致玻璃化苗的產生，采用1.0 mg/L 6-BA與0.1 mg/L NAA組合可使玻

璃化芽苗恢復正常生長。

卡那霉素是植物轉基因研究中最常用的篩選標記，不同物種、基因型及外植體材料對卡那霉素的敏感性存在較大差異[7]。篩選用卡那霉素的最佳濃度是一方面可有效抑制非轉化組織的生長，另一方面能使轉化組織正常發芽和生長發育[8-9]。通過系統研究不同濃度卡那霉素對M7葉片再生、芽增殖及生根的影響，明確了適宜M7篩選用的最佳濃度。蘋果M7砧木葉片愈傷組織形成對卡那霉素的敏感濃度為 20 mg/L，抑制葉片愈傷組織生根的卡那霉素濃度為5 mg/L；M7新梢增殖與生根對卡那霉素的敏感濃度分別為40、10 mg/L。

參考文獻：

[1]程家勝，鄂超蘇，田穎川，等. 轉Bt抗蟲基因蘋果植株的再生[J]. 中國果樹，1994（4）：14-15.

[2]Duan Y X，Guo W W，Meng H J，et al. High efficient transgenic plant regeneration from embryogenic calluses of Citrus sinensis[J]. Biologia Plantarum，2007，51（2）：212-216.

[3]王紫萱，易自力. 卡那霉素在植物轉基因中的應用及其抗性基因的生物安全性評價[J]. 中國生物工程雜志，2003，23（6）：9-13.

[4]魏國芹，梁美霞，李鼎立，等. 平邑甜茶與M7離體葉片不定芽再生的研究[J]. 青島農業大學學報：自然科學版，2009，26（2）：103-108.

[5]張洪勝，牟云官，辛培剛. 蘋果離體培養中試管苗玻璃化現象發生機理的探討[J]. 果樹科學，1991，8（2）：71-74.

[6]高遐虹，李梅，張桂鳳. 蘋果砧木試管苗發生玻璃化的因素及預防[J]. 北京農學院學報，1997，12（2）：16-19.

[7]魏愛民，張文珠，杜勝利，等. 黃瓜花粉管通道法抗蟲基因導入及卡那霉素抗性篩選[J]. 華北農學報，2008，23（6）：54-57.

[8]王峰，盧永恩，李漢霞. 幾種白菜類蔬菜卡那霉素抗性的研究[J]. 武漢植物學研究，2006，24（4）：377-380.

[9]徐鵬飛，張淑珍，吳俊江，等. 利用卡那霉素對花粉管通道法轉基因大豆的篩選研究[J]. 大豆科學，2006（3）：275-278.

2.4M7新梢生根對卡那霉素敏感性

由表2看出，M7新梢生根數隨卡那霉素濃度的升高而明顯下降，且芽苗不斷變黃甚至白化死亡。卡那霉素濃度為 0 mg/L時，芽苗生根率100%（圖3-A），平均每棵苗生根數為2～3條，并且根生長粗壯，白色，生長較快；卡那霉素濃度為5 mg/L時，生根率10%，根白色，生長明顯減慢；卡那霉素濃度為10 mg/L時，新梢不能生根（圖3-B），可見 ≥10 mg/L 卡那霉素可以完全抑制M7芽苗的生根。

表1卡那霉素對M7新梢增殖的影響

卡那霉素濃度

（mg/L）接種芽數

（個）芽再生情況芽增殖倍數芽生長狀況（健壯與否）0407.8綠色，健壯10402.5黃綠色，生長較弱20400.4黃綠色，幾乎不生長40400無

表2卡那霉素對M7新梢生根的影響

卡那霉素濃度

（mg/L）接種芽數

（個）生根數量

（條）根生長情況01235白色，健壯，生長較快5122白色，生長較慢10120無20120無

3小結與討論

玻璃化現象是一種生理病態現象，也是蘋果莖尖培養時

經常遇到的問題，發生玻璃化的材料呈半透明水漬狀，生長緩慢、繁殖系數低，偶爾可在延長培養期間恢復正常生長，但通常比率很低。導致這種現象的原因，張洪勝等認為是培養環境中的某種脅迫條件誘導產生應激乙烯，乙烯的直接或間接作用引起玻璃化的發生[5]；也有研究表明，改變培養時的濕度、瓊脂濃度、細胞分裂素濃度等均可有效地預防和緩解玻璃苗的發生[6]。本試驗中，采用4.0 mg/L 6-BA與0.3 mg/L IBA組合，雖然可以誘導M7大量增殖，但容易導致玻璃化苗的產生，采用1.0 mg/L 6-BA與0.1 mg/L NAA組合可使玻

璃化芽苗恢復正常生長。

卡那霉素是植物轉基因研究中最常用的篩選標記，不同物種、基因型及外植體材料對卡那霉素的敏感性存在較大差異[7]。篩選用卡那霉素的最佳濃度是一方面可有效抑制非轉化組織的生長，另一方面能使轉化組織正常發芽和生長發育[8-9]。通過系統研究不同濃度卡那霉素對M7葉片再生、芽增殖及生根的影響，明確了適宜M7篩選用的最佳濃度。蘋果M7砧木葉片愈傷組織形成對卡那霉素的敏感濃度為 20 mg/L，抑制葉片愈傷組織生根的卡那霉素濃度為5 mg/L；M7新梢增殖與生根對卡那霉素的敏感濃度分別為40、10 mg/L。

參考文獻：

[1]程家勝，鄂超蘇，田穎川，等. 轉Bt抗蟲基因蘋果植株的再生[J]. 中國果樹，1994（4）：14-15.

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[4]魏國芹，梁美霞，李鼎立，等. 平邑甜茶與M7離體葉片不定芽再生的研究[J]. 青島農業大學學報：自然科學版，2009，26（2）：103-108.

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[6]高遐虹，李梅，張桂鳳. 蘋果砧木試管苗發生玻璃化的因素及預防[J]. 北京農學院學報，1997，12（2）：16-19.

[7]魏愛民，張文珠，杜勝利，等. 黃瓜花粉管通道法抗蟲基因導入及卡那霉素抗性篩選[J]. 華北農學報，2008，23（6）：54-57.

[8]王峰，盧永恩，李漢霞. 幾種白菜類蔬菜卡那霉素抗性的研究[J]. 武漢植物學研究，2006，24（4）：377-380.

[9]徐鵬飛，張淑珍，吳俊江，等. 利用卡那霉素對花粉管通道法轉基因大豆的篩選研究[J]. 大豆科學，2006（3）：275-278.

2.4M7新梢生根對卡那霉素敏感性

由表2看出，M7新梢生根數隨卡那霉素濃度的升高而明顯下降，且芽苗不斷變黃甚至白化死亡。卡那霉素濃度為 0 mg/L時，芽苗生根率100%（圖3-A），平均每棵苗生根數為2～3條，并且根生長粗壯，白色，生長較快；卡那霉素濃度為5 mg/L時，生根率10%，根白色，生長明顯減慢；卡那霉素濃度為10 mg/L時，新梢不能生根（圖3-B），可見 ≥10 mg/L 卡那霉素可以完全抑制M7芽苗的生根。

表1卡那霉素對M7新梢增殖的影響

卡那霉素濃度

（mg/L）接種芽數

（個）芽再生情況芽增殖倍數芽生長狀況（健壯與否）0407.8綠色，健壯10402.5黃綠色，生長較弱20400.4黃綠色，幾乎不生長40400無

表2卡那霉素對M7新梢生根的影響

卡那霉素濃度

（mg/L）接種芽數

（個）生根數量

（條）根生長情況01235白色，健壯，生長較快5122白色，生長較慢10120無20120無

3小結與討論

玻璃化現象是一種生理病態現象，也是蘋果莖尖培養時

經常遇到的問題，發生玻璃化的材料呈半透明水漬狀，生長緩慢、繁殖系數低，偶爾可在延長培養期間恢復正常生長，但通常比率很低。導致這種現象的原因，張洪勝等認為是培養環境中的某種脅迫條件誘導產生應激乙烯，乙烯的直接或間接作用引起玻璃化的發生[5]；也有研究表明，改變培養時的濕度、瓊脂濃度、細胞分裂素濃度等均可有效地預防和緩解玻璃苗的發生[6]。本試驗中，采用4.0 mg/L 6-BA與0.3 mg/L IBA組合，雖然可以誘導M7大量增殖，但容易導致玻璃化苗的產生，采用1.0 mg/L 6-BA與0.1 mg/L NAA組合可使玻

璃化芽苗恢復正常生長。

卡那霉素是植物轉基因研究中最常用的篩選標記，不同物種、基因型及外植體材料對卡那霉素的敏感性存在較大差異[7]。篩選用卡那霉素的最佳濃度是一方面可有效抑制非轉化組織的生長，另一方面能使轉化組織正常發芽和生長發育[8-9]。通過系統研究不同濃度卡那霉素對M7葉片再生、芽增殖及生根的影響，明確了適宜M7篩選用的最佳濃度。蘋果M7砧木葉片愈傷組織形成對卡那霉素的敏感濃度為 20 mg/L，抑制葉片愈傷組織生根的卡那霉素濃度為5 mg/L；M7新梢增殖與生根對卡那霉素的敏感濃度分別為40、10 mg/L。

參考文獻：

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[3]王紫萱，易自力. 卡那霉素在植物轉基因中的應用及其抗性基因的生物安全性評價[J]. 中國生物工程雜志，2003，23（6）：9-13.

[4]魏國芹，梁美霞，李鼎立，等. 平邑甜茶與M7離體葉片不定芽再生的研究[J]. 青島農業大學學報：自然科學版，2009，26（2）：103-108.

[5]張洪勝，牟云官，辛培剛. 蘋果離體培養中試管苗玻璃化現象發生機理的探討[J]. 果樹科學，1991，8（2）：71-74.

[6]高遐虹，李梅，張桂鳳. 蘋果砧木試管苗發生玻璃化的因素及預防[J]. 北京農學院學報，1997，12（2）：16-19.

[7]魏愛民，張文珠，杜勝利，等. 黃瓜花粉管通道法抗蟲基因導入及卡那霉素抗性篩選[J]. 華北農學報，2008，23（6）：54-57.

[8]王峰，盧永恩，李漢霞. 幾種白菜類蔬菜卡那霉素抗性的研究[J]. 武漢植物學研究，2006，24（4）：377-380.

[9]徐鵬飛，張淑珍，吳俊江，等. 利用卡那霉素對花粉管通道法轉基因大豆的篩選研究[J]. 大豆科學，2006（3）：275-278.