一株巨大芽孢桿菌J1的生胞培養及優化

司云龍等

摘要：以巨大芽孢桿菌J1為材料，利用溶磷圈法測定了菌株的解磷能力，優化了菌株的最佳發酵條件、最適培養基。結果表明，此菌株溶磷效果明顯；此菌株生長的最適培養時間為 28 h，最適接種量為6.7%，最適pH值為8.5；最佳碳源為玉米粉與葡萄糖的復合碳源，最佳氮源為大豆粉與硫酸銨的復合氮源。搖瓶培養的接種量為6.7%，pH值為8.5，250 mL 三角瓶中最適裝液體積為 30 mL，培養溫度為30 ℃，培養時間為28 h，最適宜轉速為180 r/min的搖瓶培養條件下，巨大芽孢桿菌活菌數各影響因素最佳組合為：玉米粉20 g/L，葡萄糖5 g/L，大豆粉7.5 g/L，硫酸銨 0.33 g/L，各因子對巨大芽孢桿菌活菌數的影響由大到小依次為：硫酸銨濃度>玉米粉濃度>葡萄糖濃度>大豆粉濃度。

關鍵詞：巨大芽孢桿菌；培養基；芽孢率；氮源；碳源；培養條件

中圖分類號： S144.9文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2014）10-0359-03

收稿日期：2013-12-11

基金項目：國家級大學生創新創業訓練計劃（編號：201210449130）。

作者簡介：司云龍（1990—），男，從事微生物肥料研究。E-mail：xiaosiwuqing@163.com。

通信作者：任麗麗，講師，從事微生物肥料研究。E-mail：tutuya_001g@163.com。植物生長發育過程中，磷元素以多種方式參與生物體內的代謝過程，是植物不可缺少的大量元素之一[1-2]。土壤中的磷元素主要以難溶磷酸鹽的形式存在，可溶性磷含量很少。據統計，世界土壤的平均含磷量約為0.04%，我國土壤的平均含磷量為0.02%～0.1%，南方酸性土壤含磷量低于0.04%[3-4]。研究發現，土壤中存在解磷微生物，它們能夠將磷酸鹽轉化為可溶性磷供植物吸收利用，解磷菌還可以產生有機酸、生長素、抗生素等物質，刺激作物生長，抑制病原菌生長，改善土壤微環境，從而更有利于植物生長發育[5-9]。目前對磷細菌的研究僅局限于菌種分離選育及作用效果比較方面，對于影響磷細菌生長的因素研究較少[10-13]。微生物種類多樣，發酵過程中受各種因素的影響，導致菌株發酵水平相對較低[14]。本試驗探討環境因素對巨大芽孢桿菌生長的影響，并在此基礎上探討該菌的最佳發酵條件，旨在為擴大巨大芽孢桿菌生產規模提供理論依據。

1材料與方法

1.1材料

巨大芽孢桿菌J1由山東京博控股股份有限公司技術中心生物化工研究所提供。

1.2培養基

搖瓶基礎培養基：玉米粉 30 g，大豆粉15 g，K2HPO4 2.0 g，MgSO4 2.0 g，CaCO3 1.5 g，MnSO4 0.05 g，H2O 1 000 mL，pH 值為7。平板培養基：蛋白胨10 g，氯化鈉 5.0 g，牛肉膏粉 3.0 g，瓊脂15 g，H2O 1 000 mL。蛋黃培養基：將50%的蛋黃液按照6%的比例加入平板培養基中。

1.3方法

1.3.1巨大芽孢桿菌J1解磷效能測定 根據巨大芽孢桿菌J1在蛋黃培養基上形成的透明圈直徑判斷其解磷效能。

1.3.2培養條件對巨大芽孢桿菌J1生長的影響

1.3.2.1pH值對巨大芽孢桿菌J1生長的影響采用搖瓶基礎培養基培養，分別于pH 值為5.5、6.5、7.5、8.5情況下180 r/min、30 ℃ 振蕩培養28 h 后進行平板計數。

1.3.2.2培養時間對巨大芽孢桿菌J1生長的影響采用搖瓶基礎培養基培養，在pH值為8.5、轉速為175 r/min、30 ℃ 下分別振蕩培養24、28、32、36 h后進行計數。

1.3.2.3接種量對巨大芽孢桿菌J1生長的影響采用搖瓶基礎培養基，在 pH值為8.5、轉速為180 r/min條件下將接種量分別為 3.3%、6.7%、10.0%的搖瓶置于振蕩培養箱中30 ℃ 培養28 h 后進行計數。

1.3.3最適培養條件下發酵培養基的優化按照設計方案，配制不同的培養基，250 mL三角瓶中每瓶裝量30 mL，原始pH 值為8.5，接種量為6.7%，180 r/min培養28 h后平板計數，采用正交試驗法找出最適培養基及最佳碳源、氮源。

2結果與分析

2.1巨大芽孢桿菌J1解磷能力的測定

由圖1可知，巨大芽孢桿菌J1在蛋黃培養基上培養2 d可產生明顯的溶磷圈，溶磷圈直徑與菌落直徑比值高達4.1，初步判斷巨大芽孢桿菌有解磷能力。

2.2pH值對巨大芽孢桿菌J1菌株生長的影響

由圖2可知，巨大芽孢桿菌J1在各pH值下長勢良好，在pH值為 8.5條件下生長最好，活菌數達35×107 CFU/mL。

2.3培養時間對巨大芽孢桿菌J1生長的影響

由圖3可知，培養28 h 菌株生長最好，活菌數為 35×107 CFU/mL，芽孢率為84%，到達某一時間拐點后繼續培養，菌體會出現自溶現象。

2.4接種量對巨大芽孢桿菌J1生長的影響

接種量對菌體生長有影響，所以接種量要適度，接種量過低會導致延滯期過長，菌體量不高；接種量過高，帶入培養基內的代謝產物過多，反而不利于菌體生長。由圖4可知，當接種量為 6.7% 時，菌株生長最好，活菌數為36×107 CFU/mL，芽孢率為86% 。

2.5碳源對巨大芽孢桿菌J1生長的影響

分別用30 g/L玉米粉、10 g/L葡萄糖、復合碳源（玉米粉、葡萄糖各減半混合在一起）配制碳源培養基，其他成分同搖瓶基礎培養基。接種后按照上述最佳培養條件，測定活菌總數及芽孢數，結果表明，采用玉米粉與葡萄糖的復合碳源作為培養基獲得的活菌數、芽孢數較高，活菌數達到36×107 CFU/mL，芽孢數達到35×107 CFU/mL（圖5）。

2.6氮源對巨大芽孢桿菌J1生長的影響

以玉米粉為碳源，在搖瓶基礎培養基中其他成分不變的情況下，分別以15.0 g/L大豆粉、0.67 g/L硫酸銨、復合氮源（大豆粉、硫酸銨各減半）配制氮源培養基，接種后按照上述最佳培養條件，測定活菌數及芽孢數，結果表明，采用復合氮源培養基獲得的活菌數、芽孢數較高，活菌數達 35×107 CFU/mL，芽孢數達33×107 CFU/mL，芽孢率達9591%（圖6）。

2.7正交試驗結果

以玉米粉與葡萄糖混合物作為碳源，以大豆粉、硫酸銨混合物作為氮源，結果表明，最佳組合為玉米粉20 g/L，葡萄糖5.0 g/L，大

3結論與討論

巨大芽孢桿菌J1具有較強的解磷能力，在蛋黃培養基上解磷圈明顯。在培養基配方為玉米粉30 g，大豆粉15 g，磷酸氫二鉀2.0 g，硫酸鎂2.0 g，碳酸鈣1.5 g，硫酸錳5.0 g，蒸餾水1 000 mL，轉速為180 r/min，溫度為30 ℃ 的培養條件下，巨大芽孢桿菌的最適pH值為8.5，活菌數達 35×107 CFU/mL；最適培養時間為28 h，活菌數達到35×107 CFU/mL，芽孢率為84%；最適接種量為6.7%，活菌數達36×107 CFU/mL，芽孢率為86%。本研究表明，培養基成分是影響芽孢形成的重要因素。巨大芽孢桿菌對于碳源、氮源及 Mg2+、Mn2+、Ca2+、Fe2+等離子反應較敏感[15]。培養基配方不同直接導致發酵菌數存在巨大差異。搖瓶培養的接種量為67%，pH值為85，250 mL三角瓶中最適裝液體積為 30 mL，培養溫度為 30 ℃，培養時間為28 h，最適宜轉速為180 r/min的搖瓶培養條件下，巨大芽孢桿菌活菌數各影響因素最佳組合為：玉米粉 20 g/L，葡萄糖5.0 g/L，黃豆粉7.5 g/L，硫酸銨0.33 g/L，各因子對巨大芽孢桿菌活菌數的影響由大到小依次為：硫酸銨濃度>玉米粉濃度>葡萄糖濃度>大豆粉濃度。 芽孢的形成是一個極其復雜的過程，受形態結構、化學成分等多方面因素的影響。巨大芽孢桿菌培養成功關鍵在于獲得較高活菌數的同時提高芽孢轉化率。本研究表明，巨大芽孢桿菌J1營養要求比較低，所需原料來源廣、成本低、芽孢率較高。本試驗獲得的最佳培養條件可以進一步應用于大規模工業化生產中。

參考文獻：

[1]Wallander H. Uptake of P from apatite by Pinus sylvestris seedlings colonised by different ectomycorrhizal fungi[J]. Plant and Soil，2000，218（1/2）：249-256.

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[5]梁錦鋒. 解磷細菌（Bacillus megaterium var. phosphaticum）生長條件及解磷機理的研究[D]. 杭州：浙江大學，2001.

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[9]林啟美，趙小蓉，孫炎鑫，等. 四種不同生態系統的土壤解磷細菌數量及種群分布[J]. 土壤與環境，2000，9（1）：34-37.

[10]李福后，王偉霞，潘建梅. 有機磷分解細菌的選育及其發酵條件的研究[J]. 中國土壤與肥料，2007（6）：74-77.

[11]陳凱，李紀順，楊合同，等. 巨大芽孢桿菌P1的解磷效果與發酵條件研究[J]. 中國土壤與肥料，2010（4）：73-76.

[12]葉云峰，黎起秦，袁高慶，等. 枯草芽孢桿菌B47菌株高產抗菌物質的培養基及發酵條件優化[J]. 微生物學通報，2011，38（9）：1339-1346.

[13]郭夏麗，狄源寧，王巖. 枯草芽孢桿菌產芽孢條件的優化[J]. 中國土壤與肥料，2012（3）：99-103.

[14]梁錦鋒，陳欣，唐建軍. 1株磷細菌基本培養條件的研究[J]. 浙江林學院學報，2002，19（4）：8-11.

[15]張文芝，郭堅華. 微生物發酵工藝優化研究進展[J]. 廣東農業科學，2013（6）：114-117.

2.6氮源對巨大芽孢桿菌J1生長的影響

以玉米粉為碳源，在搖瓶基礎培養基中其他成分不變的情況下，分別以15.0 g/L大豆粉、0.67 g/L硫酸銨、復合氮源（大豆粉、硫酸銨各減半）配制氮源培養基，接種后按照上述最佳培養條件，測定活菌數及芽孢數，結果表明，采用復合氮源培養基獲得的活菌數、芽孢數較高，活菌數達 35×107 CFU/mL，芽孢數達33×107 CFU/mL，芽孢率達9591%（圖6）。

2.7正交試驗結果

以玉米粉與葡萄糖混合物作為碳源，以大豆粉、硫酸銨混合物作為氮源，結果表明，最佳組合為玉米粉20 g/L，葡萄糖5.0 g/L，大

3結論與討論

巨大芽孢桿菌J1具有較強的解磷能力，在蛋黃培養基上解磷圈明顯。在培養基配方為玉米粉30 g，大豆粉15 g，磷酸氫二鉀2.0 g，硫酸鎂2.0 g，碳酸鈣1.5 g，硫酸錳5.0 g，蒸餾水1 000 mL，轉速為180 r/min，溫度為30 ℃ 的培養條件下，巨大芽孢桿菌的最適pH值為8.5，活菌數達 35×107 CFU/mL；最適培養時間為28 h，活菌數達到35×107 CFU/mL，芽孢率為84%；最適接種量為6.7%，活菌數達36×107 CFU/mL，芽孢率為86%。本研究表明，培養基成分是影響芽孢形成的重要因素。巨大芽孢桿菌對于碳源、氮源及 Mg2+、Mn2+、Ca2+、Fe2+等離子反應較敏感[15]。培養基配方不同直接導致發酵菌數存在巨大差異。搖瓶培養的接種量為67%，pH值為85，250 mL三角瓶中最適裝液體積為 30 mL，培養溫度為 30 ℃，培養時間為28 h，最適宜轉速為180 r/min的搖瓶培養條件下，巨大芽孢桿菌活菌數各影響因素最佳組合為：玉米粉 20 g/L，葡萄糖5.0 g/L，黃豆粉7.5 g/L，硫酸銨0.33 g/L，各因子對巨大芽孢桿菌活菌數的影響由大到小依次為：硫酸銨濃度>玉米粉濃度>葡萄糖濃度>大豆粉濃度。 芽孢的形成是一個極其復雜的過程，受形態結構、化學成分等多方面因素的影響。巨大芽孢桿菌培養成功關鍵在于獲得較高活菌數的同時提高芽孢轉化率。本研究表明，巨大芽孢桿菌J1營養要求比較低，所需原料來源廣、成本低、芽孢率較高。本試驗獲得的最佳培養條件可以進一步應用于大規模工業化生產中。

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2.6氮源對巨大芽孢桿菌J1生長的影響

以玉米粉為碳源，在搖瓶基礎培養基中其他成分不變的情況下，分別以15.0 g/L大豆粉、0.67 g/L硫酸銨、復合氮源（大豆粉、硫酸銨各減半）配制氮源培養基，接種后按照上述最佳培養條件，測定活菌數及芽孢數，結果表明，采用復合氮源培養基獲得的活菌數、芽孢數較高，活菌數達 35×107 CFU/mL，芽孢數達33×107 CFU/mL，芽孢率達9591%（圖6）。

2.7正交試驗結果

以玉米粉與葡萄糖混合物作為碳源，以大豆粉、硫酸銨混合物作為氮源，結果表明，最佳組合為玉米粉20 g/L，葡萄糖5.0 g/L，大

3結論與討論

巨大芽孢桿菌J1具有較強的解磷能力，在蛋黃培養基上解磷圈明顯。在培養基配方為玉米粉30 g，大豆粉15 g，磷酸氫二鉀2.0 g，硫酸鎂2.0 g，碳酸鈣1.5 g，硫酸錳5.0 g，蒸餾水1 000 mL，轉速為180 r/min，溫度為30 ℃ 的培養條件下，巨大芽孢桿菌的最適pH值為8.5，活菌數達 35×107 CFU/mL；最適培養時間為28 h，活菌數達到35×107 CFU/mL，芽孢率為84%；最適接種量為6.7%，活菌數達36×107 CFU/mL，芽孢率為86%。本研究表明，培養基成分是影響芽孢形成的重要因素。巨大芽孢桿菌對于碳源、氮源及 Mg2+、Mn2+、Ca2+、Fe2+等離子反應較敏感[15]。培養基配方不同直接導致發酵菌數存在巨大差異。搖瓶培養的接種量為67%，pH值為85，250 mL三角瓶中最適裝液體積為 30 mL，培養溫度為 30 ℃，培養時間為28 h，最適宜轉速為180 r/min的搖瓶培養條件下，巨大芽孢桿菌活菌數各影響因素最佳組合為：玉米粉 20 g/L，葡萄糖5.0 g/L，黃豆粉7.5 g/L，硫酸銨0.33 g/L，各因子對巨大芽孢桿菌活菌數的影響由大到小依次為：硫酸銨濃度>玉米粉濃度>葡萄糖濃度>大豆粉濃度。 芽孢的形成是一個極其復雜的過程，受形態結構、化學成分等多方面因素的影響。巨大芽孢桿菌培養成功關鍵在于獲得較高活菌數的同時提高芽孢轉化率。本研究表明，巨大芽孢桿菌J1營養要求比較低，所需原料來源廣、成本低、芽孢率較高。本試驗獲得的最佳培養條件可以進一步應用于大規模工業化生產中。

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[4]孫波，張桃林，趙其國. 南方紅壤丘陵區土壤養分貧瘠化的綜合評價[J]. 土壤，1995（3）：119-128.

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[10]李福后，王偉霞，潘建梅. 有機磷分解細菌的選育及其發酵條件的研究[J]. 中國土壤與肥料，2007（6）：74-77.

[11]陳凱，李紀順，楊合同，等. 巨大芽孢桿菌P1的解磷效果與發酵條件研究[J]. 中國土壤與肥料，2010（4）：73-76.

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[14]梁錦鋒，陳欣，唐建軍. 1株磷細菌基本培養條件的研究[J]. 浙江林學院學報，2002，19（4）：8-11.

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