山東省部分地區禽源致病性大腸桿菌的血清流行病學調查與耐藥性檢測

刁有江，范學政

（1.山東農業工程學院，濟南250100；2.中國獸醫藥品監察所，北京100081）

禽大腸桿菌病是由某些致病性大腸桿菌引起的家禽多種傳染性疾病的總稱［1-3］。該病是山東省規模化養禽場的常見病，發病率高，死亡率高，常與慢性呼吸道病、H9亞型禽流感等呼吸道疾病混合感染，給養禽業造成極大損失。為了有效開展禽大腸桿菌病的預防和治療工作，本研究對采自山東濰坊、煙臺、臨沂等8地市的家禽病料進行了禽源致病性大腸桿菌的分離、血清型流行病學調查，并對分離到的大腸桿菌進行了耐藥性檢測和分析，以期為疫苗的研制和臨床用藥提供依據。

1 材料與方法

1.1 病料 在2012年1～12月間，從山東省濰坊、臨沂、青島、煙臺、德州、濱州、聊城、濟寧8個地區的45家養禽場收集到128只初診為大腸桿菌病的病死雞。無菌采集病死雞的肝臟、脾臟、心血等病料，用于病原菌的分離。

1.2 大腸桿菌標準抗O血清 20種大腸桿菌單因子抗O血清由中國獸醫藥品監察所提供。

1.3 試驗動物 10日齡健康海蘭白雛公雞購自濟南百事得牧業有限公司養雞場。

1.4 質控菌株 大腸桿菌 ATCC25922、ATCC35218由吉林大學畜牧獸醫學院獸醫藥理實驗室惠贈。

1.5 培養基和試劑 麥康凱培養基為北京奧博星生物技術責任有限公司產品；MH肉湯、LB肉湯為杭州天和微生物試劑有限公司產品；普通營養瓊脂及葡萄糖、甘露醇、麥芽糖等10種生化培養基等為上海市醫學化驗所試劑廠產品。磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉、氯化鈉等試劑為天津金匯太亞化學試劑有限公司產品。

1.6 抗菌藥物 氟苯尼考、硫酸粘菌素、痢菌凈、土霉素、磺胺甲基異噁唑、甲氧芐啶為濟南美事達獸藥有限公司惠贈，其他藥品均購自中國食品藥品檢定研究院。

1.7 病原菌的分離培養 無菌采集病死雞的肝臟、脾臟、心血等病料，劃線于麥康凱斜面，37℃培養18 h，挑取典型菌落在麥康凱平板上分區劃線，37℃培養18 h，選取單個典型菌落純培養后4℃冰箱暫存備用。取培養物，按常規方法進行涂片、革蘭氏染色，對菌體形態、染色特性及莢膜進行鏡檢。

1.8 生化特性 按常規方法［4］，對分離到的大腸桿菌進行三糖鐵試驗、吲哚試驗等生化測定。

1.9 血清型鑒定 取被檢細菌純培養物用生理鹽水離心、洗滌2次，稀釋成100×108／mL的菌懸液，用水煮沸2.5 h，破壞其莢膜抗原。應用微量凝集試驗，用大腸桿菌標準抗“O”血清，對所分離的菌株進行血清型的鑒定［5］。定型標準為血清的試管凝集價不小于 1 ∶640［3］。

1.10 致病性試驗 挑取普通瓊脂斜面上純培養的菌落，接種于LB肉湯培養基中，靜置培養24 h作為接種液。每株大腸桿菌培養物各隨機腹腔注射5只10日齡健康雛公雞0.2 mL（每mL含約108CFU），作為一個試驗組。另取5只雛公雞腹腔注射0.2 mL肉湯作為對照。在96 h內觀察其發病與死亡情況，并進行細菌的分離。根據雞的死亡數確定分離株的致病性［1］：接種雞死亡率超過50%，定為高致病株；接種雞有死亡，但死亡率低于50%，定為中等致病株；接種雞96 h內無死亡，定為低致病性分離株。

1.11 耐藥性檢測 參考美國臨床和實驗室標準化研究所（CLSI）出版的抗菌藥物敏感試驗執行標準中的藥敏試驗方法［6］，采用微量肉湯稀釋法對大腸桿菌分離株進行耐藥性檢測，并以大腸桿菌ATCC25922和ATCC35218為質控菌株。本研究中所用抗菌藥物的種類、相應的測定濃度及藥敏試驗結果判定標準見表1。中介菌株計入耐藥株范圍內。

表1 抗菌藥物的種類、測定濃度及判定標準

2 結果

2.1 細菌分離 從128份病死雞中，共分離到細菌103株。

2.2 生化反應 經生化鑒定，有96個分離株的生化反應符合大腸桿菌的特征。

2.3 血清型鑒定 對分離鑒定的96株致病性大腸桿菌進行血清型鑒定，共鑒定出75株大腸桿菌的血清型，占分離菌株的78.13%。此外，有15個分離株未能定型，占分離菌株的15.62%；有6個分離株發生自凝，占分離菌株的6.25%。

75株定型的菌株分屬18種血清型（表2），優勢血清型為 O78、O2、O18、O15、O88、O143，這 6 種血清型的菌株占定型菌株的64%。

表2 已定型的75個分離株的血清型

2.4 致病性試驗 雛雞接種大腸桿菌后96 h內，有94個試驗組死亡率超過50%，另外2個試驗組的接種雞有死亡但死亡率低于50%，從接種后死亡雞體內均能分離到接種菌。健康對照雞均健活。說明本次分離到的大腸桿菌有94株為高致病性大腸桿菌，其他2株為中等致病性大腸桿菌。高致病株引起接種雞高死亡率，致死比例多為4／5～5／5；中度致病株引起接種雞較低死亡率，致死比例為1／5～2／5。接種后 24 h以內死亡的試驗雞眼觀病變主要表現為心包積液、氣囊混濁以及肝臟腫大、淤血；接種48 h以后死亡的試驗雞，可以見到纖維素性心包炎、肝周炎、氣囊炎等典型病變。高致病性分離株引起試驗雞在接種后24 h內出現死亡高峰。已定型的75個分離株的致病性試驗結果詳見表3。

表3 75株已定型大腸桿菌的致病性試驗結果

2.5 耐藥性檢測 96株大腸桿菌對20種藥物的敏感性檢測結果如表4。質控菌株大腸桿菌ATCC25922、ATCC35218的測定結果均在質控范圍內，說明藥物敏感性檢測結果可靠。

在被測藥物中，75%以上的菌株對氨芐青霉素、阿莫西林、土霉素、痢菌凈、恩諾沙星等5種抗菌藥耐受，所有大腸桿菌分離株對土霉素均表現為耐藥；除此之外，還有50%以上的菌株對卡那霉素、多西環素、環丙沙星、左氧氟沙星、諾氟沙星、磺胺甲基異噁唑／甲氧芐啶以及粘菌素等7種抗菌藥表現為耐藥。除土霉素外，經χ2檢驗，針對某種抗菌藥的敏感菌株在各地區的分布情況，存在一定差異，但總體差異不顯著（P＞0.05）。

表4 抗菌藥物敏感性試驗結果

2.6 大腸桿菌的多重耐藥性 96株大腸桿菌對被測的20種藥物存在不同程度的多重耐藥現象（圖1），受檢菌至少對4種藥物耐受；75%的受檢菌對9種及9種以上的被測藥物耐受，耐藥類型為10～14重耐藥的大腸桿菌所占比例最大，占受檢菌的58.33%。對被測藥物耐受種類最多的大腸桿菌有2株，耐藥類型為17重耐藥，占受檢菌的2.08%。96株大腸桿菌共有57種耐藥譜。

圖1 96株大腸桿菌多重耐藥類型圖

3 結果

3.1 一般認為，禽源致病性大腸桿菌血清型最常見的為 O1、O2、O35和 O78［2］，本研究鑒定山東部分地區的優勢血清型為 O78、O2、O15、O18、O88、O143，與國內資料報道的山東地區的優勢血清型有相吻合的部分，也有差異存在［7-10］。通過對省內一些養禽場的跟蹤調查發現，同一禽場同批發病禽群中存在多種血清型，且同一禽場在不同時期流行株的血清型也有所差異，不同禽場之間差異更大。因此，在大腸桿菌的免疫預防中，應充分考慮其血清型的多樣性、易變性。本次試驗中血清型的鑒定為山東省禽大腸桿菌病的防制提供了理論依據。

3.2 據報道，某種抗菌藥物耐藥率的多少與區域內該藥物的使用頻度成正比［11］。細菌長期接觸某種抗菌藥物所產生的選擇性壓力導致了耐藥性的產生［12］。本次試驗中受檢菌株對用藥歷史較久、應用廣泛的常規抗菌藥物如土霉素、氨芐青霉素、恩諾沙星、痢菌凈、阿莫西林等耐藥嚴重。法定獸用抗菌藥中僅有使用頻率較低的阿莫西林／棒酸敏感率高。曾對大腸桿菌比較敏感的氟苯尼考、慶大霉素、恩諾沙星、環丙沙星、左氧氟沙星等在廣泛使用的過程中均產生了不同程度的耐藥性。除阿莫西林／棒酸以外，細菌對尚未批準為獸用藥、使用頻率相對較低的頭孢噻肟、頭孢曲松、頭孢他啶、阿米卡星、加替沙星敏感率較高。

本研究的多重耐藥情況與劉遠飛等的報道相近［13］，說明禽源致病性大腸桿菌的多重耐藥性在山東地區普遍存在。禽源致病性大腸桿菌多藥耐藥性產生的原因，與長期以來我國養禽業從業者對抗菌藥物的濫用有關［14］。通過對省內一些規模化養禽場的跟蹤調查發現，無指征投用抗菌藥物的現象普遍存在。抗菌藥物的不規范使用導致了多藥耐藥性致病性大腸桿菌的散播［15］。

因此，規模化養禽場在加強飼養管理的同時，應定期進行大腸桿菌的分離鑒定和抗菌藥物敏感性的檢測。選用有針對性的菌株作為菌苗；根據藥敏試驗結果，選擇敏感藥物，且應注意規范用藥，必要時可以進行聯合用藥，以有效控制大腸桿菌病的流行。

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