高效液相色譜-四級桿/線性離子阱質(zhì)譜法篩查獸藥中非法添加物的研究

周 煒，陳慧華，應(yīng)永飛，陸春波，林仙軍，朱聰英

(浙江省畜產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測中心，杭州310020)

2013年3月，本實驗室收到某品牌獸藥樣品若干，經(jīng)調(diào)查這些獸藥明顯具有標(biāo)簽外藥物的生理/藥理學(xué)作用，即可明顯促進育肥豬采食、提高出肉率，但具體是其中哪種藥及具體成分不明。為配合相關(guān)行政執(zhí)法部門嚴厲打擊畜產(chǎn)品質(zhì)量安全犯罪、超范圍濫用獸藥等違法行為，保障畜產(chǎn)品質(zhì)量安全，急需對其中非法添加的未知成分進行篩查與確證。

目前，國際上多用核磁法和飛行時間質(zhì)譜法等技術(shù)對某種未知成分進行定性分析［1-2］。但這些技術(shù)對儀器的要求，限制了其應(yīng)用與推廣。自20世紀(jì)50年代開始，基于常規(guī)四級桿質(zhì)譜發(fā)展而來的四級桿/線性離子阱質(zhì)譜技術(shù)日趨成熟［3-4］，已廣泛應(yīng)用于檢驗檢測領(lǐng)域。針對離子阱可進行選擇性離子富集與裂解功能而研發(fā)的增強子離子掃描(Enhanced Product Ion Scan，EPI)技術(shù)，可根據(jù)可疑目標(biāo)化合物的質(zhì)荷比、裂解規(guī)律等參數(shù)，自動與已建譜庫中的化合物進行匹配分析，從而實現(xiàn)對復(fù)雜基質(zhì)中目標(biāo)化合物的確證與測定［5-6］。然而，迄今為止，利用四極桿/線性離子阱質(zhì)譜對未知物進行篩查的方法鮮有報道。本研究旨在以如何確證上述獸藥中非法添加氯丙那林的過程為例，初步探討了四級桿/線性離子阱質(zhì)譜在獸藥非法添加物篩查中的運用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器 Agilent 1290N高效液相色譜儀(美國Agilent公司);AB 5500 Q-Trap質(zhì)譜儀(美國AB公司)，配電噴霧離子源(ESI);電子天平(瑞士Mettler，精度十萬分之一);離心機(德國Sigma公司)。

1.1.2 試劑與藥品 試驗用甲醇、乙腈、醋酸鉛均為分析純，甲酸及作為流動相的甲醇均為色譜純，水為超純水。氯丙那林(Clorprenaline，CLN)標(biāo)準(zhǔn)品購自Witega公司。所檢陽性樣品(包含:水性溶劑注射液、非水性溶劑注射液和中獸藥散劑等三種劑型)及相應(yīng)陰性對照樣品均來自公安和農(nóng)業(yè)行政執(zhí)法部門。

1.1.3 EPI譜庫 本實驗室已對激素類、鎮(zhèn)定劑/抑郁藥類、脫羧酶抑制劑類、中樞神經(jīng)興奮劑類、抗病毒類等五大類藥物進行了EPI譜庫建立，譜庫中“瘦肉精”類藥物包括:馬噴特羅、溴代克倫特羅、克倫塞羅、克倫異磅特羅、克倫潘特、羥甲基克倫特羅、Clenhexerol、馬布特羅、妥布特羅、溴布特羅、氯丙那林、噴布特羅、西布特羅、特布他林、非諾特羅、克倫普羅、西馬特羅、萊克多巴胺、齊帕特羅、班布特羅、沙丁胺醇、丙卡特羅、克倫特羅、福莫特羅(阿福特羅)、苯乙醇胺A等25種藥物。

1.2 方法

1.2.1 樣品前處理 結(jié)合目標(biāo)化合物的生物學(xué)功用，推測其極有可能屬于“瘦肉精”類化合物。由于“瘦肉精”類化合物多易溶于水，故本試驗均采用水溶性目標(biāo)化合物處理方法。

水性溶劑注射液:量取供試品適量，用0.2%甲酸水稀釋依次成100倍、104倍和106倍稀釋液，按濃度從低到高過膜上機，直至檢測濃度適宜為止。

非水性溶劑注射液與中獸藥散劑:取相應(yīng)供試品適量(非水性溶劑注射液:5.0 mL;中獸藥散劑:5.0 g)于50 mL離心管中，加入20 mL 0.2%甲酸水，水浴超聲提取30 min，期間每5 min振搖1次。12000 r/min離心10 min，取上清液適量，用0.2%甲酸水稀釋依次成100倍、104倍和106倍稀釋液，按濃度從低到高過膜上機，直至檢測濃度適宜為止。

1.2.2 靶目標(biāo)分子篩查方法 為得到目標(biāo)化合物的分子質(zhì)量數(shù)信息，本研究采用Q3全掃描方式，通過比較樣品與陰性對照的差異，獲取靶目標(biāo)化合物的分子質(zhì)量。

質(zhì)譜條件:采集模式為蠕動泵進樣，ESI+模式Q3全掃描;泵流速為5 μL/min;離子源電壓5500 V;輔助加熱氣溫度550℃;氣簾氣流速40 L/h;離子源氣流流速霧化氣(Gas1)15 L/h、輔助氣(Gas2)20 L/h;DP(Declustering Potential，去簇電壓)50 eV;碰撞室入口電壓(Entrance Potential，EP)10 eV;碰撞室出口電壓(Collision Cell Exit Potential，CXP)10 eV;掃描速率200 Da/s。

1.2.3 靶目標(biāo)分子質(zhì)譜參數(shù)優(yōu)化 為得到質(zhì)荷比為214.2 Da的靶目標(biāo)分子準(zhǔn)確質(zhì)量數(shù)及MRM(Multiple Reaction Monitoring)模式下的質(zhì)譜參數(shù)，本試驗先用0.2%甲酸水/甲醇/乙腈(50∶25∶25，V/V)對Q3全掃描上機液進行了10倍稀釋，并依次優(yōu)化了DP、EP、母離子質(zhì)荷比、兩特征子離子的碰撞能量(Collision Energy，CE)、CXP與子離子質(zhì)荷比等參數(shù)。

1.2.4 靶目標(biāo)分子的色譜分離 在篩查得到靶目標(biāo)分子母離子質(zhì)荷比后，初步驗證了其屬于“瘦肉精”類物質(zhì)的推測，適用未知物篩查ESI+模式下的通用色譜條件進行分離。色譜條件:色譜柱:Waters Atlantis dC18 柱(3.0 mm ×150 mm，粒徑3 μm);流動相及流速見表1;柱溫:30℃;進樣量:5 μL。

表1 通用流動相和流速

根據(jù)靶目標(biāo)分子的保留時間與洗脫特性，對流動相組成進行了適當(dāng)優(yōu)化，以得到最佳色譜條件。優(yōu)化后的流動相見表2。

表2 流動相組成和流速

1.2.5 靶目標(biāo)分子的定性確證方法 在優(yōu)化了色譜條件后，本試驗用儀器自帶的“MRM-IDA(Information Dependent Acquistion)-EPI”(多反應(yīng)監(jiān)測觸發(fā)增強子離子掃描)技術(shù)進行了譜庫匹配檢索，以進一步作定性確證。

質(zhì)譜條件:MRM條件電噴霧離子源;正離子掃描;多反應(yīng)監(jiān)測;離子源電壓:5500 V;碰撞氣能量:高;輔助加熱氣溫度:550℃;氣簾氣流速:40 L/h;離子源氣流流速:Gas1為50 L/h，Gas2為35 L/h。目標(biāo)化合物MRM參數(shù)見表3。

表3 多反應(yīng)監(jiān)測條件

IDA條件［5-6］:進行IDA監(jiān)測時允許質(zhì)量數(shù)偏離范圍為±250 mDa;啟用動態(tài)背景扣除(MRM響應(yīng)值超出5000 cps，選擇1個最強離子觸發(fā)IDAEPI);當(dāng)MRM到達已建庫化合物的保留時間且響應(yīng)值超出6000 cps，強制1個最強離子觸發(fā)IDA-EPI。

EPI條件:掃描速率10000 Da/s;進行 EPI時CE為35、(35±15)eV(即最終所獲得的EPI譜圖為20、35、50 eV三個水平的碰撞能量下的疊加圖)。

2 結(jié)果與分析

2.1 靶目標(biāo)分子量篩查 本試驗通過陰性對照的方法，尋找樣品譜圖中除陰性對照樣品峰外的特征離子峰，對靶目標(biāo)母離子質(zhì)荷比進行篩查。由于四極桿質(zhì)譜中Q1部分，對質(zhì)量數(shù)的定量不能滿足試驗要求，因而采用Q2不進行碰撞裂解的Q3全掃描。掃描結(jié)果如圖1、圖2所示，所檢“扶正解毒散”樣品色譜圖中在214.2 Da處有明顯特征離子峰，與氯丙那林母離子質(zhì)荷比(213.7 Da)相近。

圖1 陰性對照樣品Q3掃描圖

圖2 樣品Q3掃描圖

2.2 靶目標(biāo)分子的色譜分離 為保障高通量定性分析的可比性，本實驗室對雌激素類、同化激素、鎮(zhèn)定劑/抑郁藥類、受體激動劑類、抗病毒類等均用ESI+離子源模式進行電離的藥物，建立了通用流動相條件，以便于直接進行MRM-IDA-EPI譜庫檢索。在初步得到驗證結(jié)果后，再對流動相條件進行進一步優(yōu)化，然后在該流動相條件下對靶目標(biāo)分子與標(biāo)準(zhǔn)物的譜圖進行匹配度查詢。通用模式下靶目標(biāo)化合物的離子流圖見圖3，優(yōu)化流動相及稀釋倍數(shù)后的靶目標(biāo)化合物的離子流圖見圖4。如圖4所示，經(jīng)優(yōu)化條件后，靶目標(biāo)化合物與基質(zhì)得到了良好分離。

2.3 靶目標(biāo)分子的定性確證 如圖5、圖6所示，在優(yōu)化色譜條件后，靶目標(biāo)化合物的保留時間(6.92 min)與氯丙那林對照品的保留時間(6.93 min)一致，均有質(zhì)荷比為 154.1 Da、119.0 Da、91.0 Da 和76.9 Da特征碎片離子，且這四個特征碎片離子的峰度比也高度一致。從圖7中可以看出，EPI譜庫檢索匹配度為93.2，遠大于80的判定標(biāo)準(zhǔn)［7-8］。根據(jù)歐盟2002/657/EC決議要求，共獲得7個識別點［7］，遠高于歐盟96/23/EC指令附錄I的A組的物質(zhì)(β-興奮劑)確認要求(4個識別點)［9］。基于如上結(jié)果，該靶目標(biāo)化合物可定性為氯丙那林。

圖3 通用模式下的總離子流圖

圖4 優(yōu)化參數(shù)后的總離子流及CLN提取離子流圖

圖5 靶目標(biāo)化合物的MRM譜圖(圖A)和EPI譜圖(圖B)

圖6 氯丙那林標(biāo)準(zhǔn)品的MRM譜圖(圖A)與EPI譜圖(圖B)

圖7 靶目標(biāo)化合物與氯丙那林標(biāo)準(zhǔn)品的EPI譜圖匹配度結(jié)果圖

3 討論

本研究以定性確證某品牌獸藥中非法添加有氯丙那林的過程為例，建立了一整套利用高效液相色譜串聯(lián)四級桿/線性離子阱質(zhì)譜對獸藥中非法添加物進行定性確證的方法，即:先從基質(zhì)中提取目標(biāo)化合物，利用Q3全掃描得到其分子質(zhì)量數(shù)，隨后對其HPLC、MRM參數(shù)進行優(yōu)化，最后利用EPI譜庫檢索進行定性確證。

利用四級桿/線性離子阱進行未知物篩查與驗證，過程可分為Target Scan和Non-target Scan兩種方式進行。Target Scan是基于已知目標(biāo)化合物可能的生理/藥理學(xué)作用一類篩查方法，主要通過數(shù)據(jù)庫比對、類似物分析兩種方法進行。Non-target Scan是針對完全未知物的一類篩查方法［3］，目前主要通過特征離子的質(zhì)量與結(jié)構(gòu)，結(jié)合這些結(jié)構(gòu)潛在的生理、藥理學(xué)作用、經(jīng)濟價值等情況進行。

本研究建立了一整套從獸藥中篩查并確證非法添加物的Target Scan方法。對于已建立譜庫的非法添加物或超標(biāo)簽范圍使用的化學(xué)成分，可利用此方法對獸藥、飼料及畜產(chǎn)品開展針對性篩查。同時，這一方法對于這些藥物的同系物或類似物的篩查也具有一定指導(dǎo)性意義。就Non-target Scan方法而言，還需要在樣品前處理過程中引入有機溶劑提取處理，在Q3全掃描和MRM方法建立時引入ESI-模式等處理方法以拓寬篩查范圍。此外，無論是Target Scan，還是Non-target Scan，尋找合適的陰性對照物、探明靶目標(biāo)化合物可能的生理/藥理學(xué)作用對于畜產(chǎn)品及相關(guān)投入品中未知物的篩查均有著至關(guān)重要的意義。

由于四級桿/線性離子阱質(zhì)譜仍屬低分辯質(zhì)譜，無法獲得飛行時間質(zhì)譜等高分辯質(zhì)譜分析時所能得到的離子精確質(zhì)量數(shù)和高通量同時掃描［1］，因而目前還只能依賴標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)及譜庫的建立，而譜庫的建立又需要長期的積累與維護。

［1］胡 莉，雷紹榮，郭靈安，等.液相色譜-離子阱-飛行時間質(zhì)譜法定性分析未知著色劑［J］.分析化學(xué)，2013，41(1):110-114.

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