HPLC－MS/MS法檢測豬肉中苯并菲啶類生物堿的研究

馮宋崗，曾建國

(湖南農業大學，獸用中藥資源與中獸藥創制國家地方聯合工程研究中心，長沙410128)

博落回(Macleaya cordata(willd.)R.Br)隸屬罌粟科，多年生草本植物，廣泛分布于我國的湖南等?。?］。血根堿(Sanguinarine，SA)與白屈菜紅堿(Chelerythrine，CHE)［2］為其主要活性成分之一。SA和CHE屬于季胺苯并菲啶類生物堿(QBAs)，是芐基異喹啉類生物堿中的一類［3－4］，具有抑菌［5－6］、抗炎［7］等效果。在歐洲，博落回提取物(Sangrovit?)已作為植物源性飼料添加劑使用多年［8］。在我國，博落回散已成功地被開發為我國第一個二類新中獸藥，并作為首個中獸藥藥物飼料添加劑批準使用，可視為后抗生素時代為解決飼用抗生素替代技術和產品。本研究以飼喂添加博落回散的飼料的豬為研究對象，對其中SA和CHE的藥物殘留檢測前處理條件和質譜條件進行優化，建立了液質聯用檢測豬肉中SA和CHE藥物殘留的方法，并為進一步驗證博落回散作為藥物飼料添加劑使用的安全性研究提供方法借鑒。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑 甲酸(質譜級，上海安譜科學儀器有限公司);甲醇(色譜純，Merk，Darmstadt，Germany);鹽酸(分析級，國藥集團);乙腈(色譜純，Merk，Darmstadt，Germany);水(Milli－ Q);正己烷(分析級，國藥集團)。血根堿對照品(批號:201101，中國藥品生物制品檢定所)，白屈菜紅堿(批號:111718－200501，中國藥品生物制品檢定所)。博落回散(批號:1303023，湖南美可達生物資源有限公司，規格:血根堿≥1.5%)。豬肉:實驗組為以博落回散作飼料添加劑的飼料(每噸添加博落回散40 g)飼喂90 d后屠宰采集;空白對照為不飼喂添加博落回散的豬肉樣品。

1.2 儀器 高效液相色譜－串聯三重四極桿質譜(HPLC－MS/MS)(美國 Agilent公司，6460型);Milli－Q Advantage A10系統(美國 MILLPORE公司);KQ5200DE型超聲波清洗器(昆山超聲儀器有限公司);ML204/02型精密天平(梅特勒－托利多(上海)儀器有限公司);渦旋混勻器，海門市其林貝爾儀器制造有限公司;低溫高速離心機(Hermle公司);氮吹儀(北京優晟聯合科技有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 對照品溶液制備 對照品稱重前在干燥器中干燥，精密稱取血根堿、白屈菜紅堿各10 mg，置于100 mL容量瓶中，加入甲醇溶解定容配制得0.1 mg/mL的對照品儲備溶液，將儲備液甲醇稀釋1000倍，制得血根堿和白屈菜紅堿均為100 ng/mL，保存于4℃。

1.3.2 供試品溶液制備 精密稱取豬肌肉1 g于50 mL的離心管中，加超純水2 mL，勻漿機勻漿，加入1%鹽酸－甲醇(10∶90，V/V)溶液15 mL，渦旋3 min，超聲萃取 20 min，10000 r/min冷凍離心10 min，上清液移入另一50 mL的離心管中;沉淀物加10 mL 1%鹽酸－甲醇(10∶90，V/V)溶液按上述方法提取，重復兩次;將三次提取的上清液合并，加10 mL正己烷脫脂，渦旋2 min，10000 r/min冷凍離心2 min，棄去上層正己烷相，剩余液體在50℃水浴下氮氣吹干，加5 mL甲醇復溶，12000 r/min冷凍離心10 min，上清液過0.22 μm 有機膜;待供試液。

1.3.3 液相色譜－質譜聯用測定條件 色譜柱:Agilent Poroshell 120 EC C18(2.1 mm ×150 mm，2.7 μm);流動相A 為0.2%甲酸溶液，流動相B 為乙腈;梯度洗脫:0～8 min，28% ～50%B;8～16 min，50% ～28%B;柱溫 35 ℃;流速 0.3 mL/min;進樣量 2 μL。

離子源:電噴霧離子源(ESI);毛細管電壓:4 kV;離子源溫度:300℃;EMV:200 V;正離子模式;脫溶劑氣和霧化氣為高純氮氣，脫溶劑氣溫度:350℃;脫溶劑氣流量:10 L/min;霧化氣壓力:45 psi;檢測方式:多重反應監測(MRM);碰撞能量、定性離子對及定量離子對等參數見表1。

表1 血根堿和白屈菜紅堿的色譜保留時間和定性、定量離子參數

2 結果與分析

2.1 線性關系考察和定量限 精密量取100 ng/mL的對照品溶液 0.05、0.10、0.20、0.50、1.00、2.00、5.00 mL，分別置于10 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻。按照上述1.3.3項，測定 SA和 CHE的峰面積，以峰面積為縱坐標(Y)，以質量濃度為橫坐標(X)繪制標準曲線，計算回歸方程分別為血根堿Y=489.87X － 107.87 ，R2=0.9996 ，白屈菜紅堿Y=1101.2X －192.35 ，R2=0.9995 ，結果表明SA 和CHE質量濃度在0.5～50 ng/mL范圍內與峰面積呈良好的線性關系。對標準溶液進行稀釋，按照上述1.3.3項對稀釋樣品進行檢測，檢測的信號強度S與背景信號強度N的比值，即信噪比，當S/N=10時樣品的最低濃度為最低定量限。經測定，本方法SA和CHE的定量限分別為0.01 ng/mL和0.04 ng/mL。

2.2 重復性和精密度 精密稱取同一頭豬同一部位肌肉6份，按照1.3.2項制備供試品溶液，并按照1.3.3項進行檢測分析，計算得到豬肉中SA和CHE的平均含量為4.75 ng/g和2.10 ng/g。相對標準偏差(RSD/%)為11.68%和9.90%，結果表示該方法重復性良好，取供試液一份，按1.3.3項方法連續進樣6次，測定峰面積，計算得SA、CHE的平均含量分別為為5.22 ng/g，2.35 ng/g，RSD 分別為2.58%和3.89%，表明儀器的精密度良好。

2.3 方法的專屬性 分別設置空白豬肉樣品組、空白豬肉樣品加SA和CHE對照品組、飼喂添加了博落回散的豬肉樣品組。按1.3.2項對三組樣品分別制備供試液，并按1.3.3項進行測定。結果如圖1、圖2、圖3、圖4所示，通過圖可以看出，SA、CHE峰型良好，且在豬肉中無內源性物質的干擾?？瞻棕i肉樣品組未發現目標峰，表明該方法的專屬性較好。

圖1 空白豬肉樣品加SA和CHE對照品組色譜圖

圖2 飼喂添加了博落回散的豬肉樣品組色譜圖

圖3 血根堿的子離子質譜圖

圖4 白屈菜紅堿的子離子質譜圖

2.4 回收率測定 在豬肉樣品中添加SA、CHE標準溶液，按 1.3.2 項制備供試品溶液，按 1.3.3 項進行檢測分析，對豬肉樣品進行3個含量水平的加樣回收實驗(每個加標濃度測3個平行樣)，3個含量水平分別為8、10、12 ng/g。結果如表2所示，從表2可以看出，本方法SA的回收率在88.5% ～94.1%之間，平均回收率為91.5%，CHE的回收率在87.9% ～93.4%，平均回收率為 91.3%，表明方法具有較好的準確度。

表2 SA和CHE加標回收率

2.5 樣品檢測 實驗組和空白對照組豬各6頭，屠宰取樣，每份樣品做兩個平行，按照1.3.2項制備供試品溶液，按1.3.3項進行檢測分析，平行樣本取平均值，結果見表3。由表3可以看出，血根堿和白屈菜紅堿在6頭豬的肌肉中的平均殘留量為4.76 ng/g和 2.09 ng/g。

表3 豬肌肉中SA、CHE殘留量檢測結果 ng/g

3 討論與小結

近年來，食源性動物產品的食品安全問題已成為社會的一個焦點問題，藥物使用過程中違禁或超規定劑量使用藥物，及添加未標示藥物成分等違規添加和濫用的現象越來越嚴重。中獸藥作為近幾年發展起來的全新方向，其有效活性成分也主要是植物次生代謝產物如生物堿、黃酮等，因此，對其在動物體內的殘留進行前瞻性的深入研究，進一步詮釋其作為飼料添加劑的安全性很有必要。

因血根堿本身帶正電荷對質譜離子源有一定的污染，研究過程中，發現空白樣品有時也有極低的陽性響應，因此需要每次檢測前進空白溶劑，驗證儀器系統沒有被污染，每次檢測結束后，對離子源進行仔細清理。本研究對樣品前處理條件進行了系統優化，發現1%鹽酸－甲醇(10∶90，V/V)的提取和沉淀蛋白效果最好，重復三次的提取能夠很大程度的提高加樣回收率。

本實驗以SA和CHE為測試對象，通過對樣品前處理條件及HPLC－MS/MS檢測條件的優化，建立了豬肉中QBAs殘留量的液質聯用檢測方法。該方法具有前處理較為簡單、經濟，靈敏度及定量準確高和專屬性強等特點，方法學驗證的各項指標均可達到實際樣品的檢測要求，可用于豬肉中痕量QBAs的殘留檢測。

［1］ 中國科學院中國植物志編委會.中國植物志［M］.北京:科學出版社，1999:78.

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［8］ Franz C，Bauer R，Tedesco D，et al.CFT/EFSA/FEEDAP/2005/.2005.01:P.140 －152［S］.