煙酸黃藤素注射液安全性試驗研究

趙 武，劉 偉，孟 菲，陸榮寶，銀慧慧，覃振華，姜源明，甘渝群，孫建華*

(1.廣西壯族自治區獸醫研究所，廣西畜禽疫苗新技術重點實驗室，南寧530001;2.廣西動物衛生監督所，南寧530001;3.廣西康普動物保健品股份有限公司，南寧530001)

黃藤素(Fibriuretinin)是我國自行研制的純天然植物藥，臨床用于治療生殖系統炎癥、外科感染、菌痢、腸炎、呼吸道以及泌尿道感染、眼結膜炎等［1］。天然黃藤素主要從防已科植物黃藤的干燥藤莖中提取獲得，是一種季胺鹽異喹啉類生物堿，主要成分為巴馬汀(Palmatine)鹽酸鹽;鹽酸巴馬汀易溶于熱水，但冷水中溶解度低，其水溶液制劑在低溫環境易結晶析出，物理性狀不穩定，不利于注射液、口服溶液劑等制劑的開發利用。為此，經過溶解性試驗和制劑穩定性試驗，篩選出性質穩定、毒性低、對動物機體無危害的煙酸作助劑，并成功制備3%煙酸黃藤素注射液。黃藤素以植物提取物形式入藥，其藥理毒理基礎研究相對比較薄弱，系統性研究鮮有資料報道;相反，時有黃藤素致過敏性休克、藥疹、腹痛、大便潛血、唾液腺腫大、肺水腫等臨床不良反應報道［2］。本研究通過溶血性試驗、肌肉刺激性試驗、口服和腹腔注射急性毒性試驗對煙酸黃藤素注射液安全性和毒性進行了評價，為進一步進行臨床試驗和臨床應用提供藥理毒理依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥物 煙酸黃藤素注射液由廣西獸醫研究所獸藥新技術研發中心與廣西康普動物保健品股份有限公司聯合制備，批號20130806，含量規格3%，性狀為黃色澄明液體。

1.1.2 試驗動物 新西蘭大耳白兔2只，雌雄各1 只，體重2.0 ～2.5 kg;昆明種小鼠，4 周齡，130 只，雌雄各半，體重18～22 g，其中30只用于預實驗，100只用于正式試驗，購自廣西醫科大學實驗動物中心，實驗動物生產許可證號:SCXK桂2009－0002。

1.2 方法

1.2.1 溶血與凝集試驗［3］

1.2.1.1 紅細胞混懸液制備 取兔耳靜脈血約20 mL，置于裝有玻璃珠的滅菌玻璃瓶內，輕輕搖動玻璃瓶約20 min，除去纖維蛋白，取出血液，加等量生理鹽水混勻，紗布過濾，濾液1500 r/min離心10 min，吸去上清液;沉淀的紅細胞再加生理鹽水清洗，離心。如此重復3～5次至上清液無色透明。最后一次3000 r/min離心沉淀10 min，按紅細胞容積加生理鹽水配成2%的紅細胞混懸液。

1.2.1.2 測定方法 取干燥無菌試管7只，1至6號試管分別加入煙酸黃藤素注射液 0.5、0.4、0.3、0.2、0.1、0 mL，生理鹽水 2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5 mL;7號試管加入蒸餾水2.5 mL，搖勻，然后向1至7號試管分別加入2.5 mL 2%紅細胞混懸液，搖勻，置于 37 ℃恒溫箱中，分別于 0.5、1、2、3 h 觀察是否有溶血及凝血現象發生。

1.2.2 肌肉刺激性試驗 參照文獻［3］方法，新西蘭兔2只，剪去兩腿外側被毛，2.5%碘酊和75%的乙醇消毒后，每只兔左、右腿股四頭肌內分別注射3%煙酸黃藤素注射液1 mL，注射后48 h處死動物，解剖取出兩側股四頭肌，縱向切開，觀察注射局部刺激反應，取局部組織標本進行病理組織學檢查。按以下標準換算相應的反應級:0級為無明顯變化;1級為輕度充血，范圍在0.5 cm×1.0 cm以下;2級為中度充血，范圍在0.5 cm×1.0 cm以上;3級為重度充血，伴有肌肉變性;4級為出現壞死，有褐色變性;5級為出現廣泛性壞死。計算出4塊股四頭肌反應級的總和。

1.2.3 小鼠急性毒性試驗［4］

1.2.3.1 口服試驗 50只小鼠，雌雄各半，隨機分為5組，每組10只(雌雄各5只)，正常給水及廣西醫科大學提供的小鼠混合飼料，觀察3 d，飲水、采食、精神狀態均正常。根據預試驗結果，灌服4200 mg/kg，小鼠100%死亡，灌服 2000 mg/kg，小鼠0%死亡。按相鄰組間距比值1.2計算5組給藥劑量為:2000、2400、2880、3456、4147 mg/kg;按劑量用灌胃針灌服。觀察小鼠飲水、采食和行為變化，以及死亡情況，剖檢觀察死亡小鼠臟器病理變化。連續觀察7 d，并作記錄。

1.2.3.2 腹腔注射試驗 50只小鼠，雌雄各半，隨機分為5組，每組10只(雌雄各5只)，正常給水及廣西醫科大學提供的小鼠混合飼料，觀察3 d，飲水、采食、精神狀態均正常。根據預試驗結果，腹腔注射劑量300 mg/kg，小鼠100%死亡，腹腔注射劑量75 mg/kg，小鼠0%死亡。按相鄰組間距比值1.4 計算 5 組給藥劑量為:75、105、147、206、288 mg/kg;按劑量腹腔注射。觀察小鼠飲水、采食和行為變化，以及死亡情況，剖檢觀察死亡小鼠臟器病理變化。連續觀察7 d，并作記錄。

2 結果

2.1 溶血與凝集試驗結果 在觀察時間內，1～6號管未見溶血和紅細胞凝聚現象，第7管溶液呈紅色透明，有溶血現象。結果表明煙酸黃藤素注射液0.1～0.5 mL在3 h內對兔紅細胞不產生溶血和凝聚作用。

2.2 肌肉刺激性試驗結果 肉眼觀察發現，1號兔左側股四頭肌輕度充血，其范圍小于0.5 cm×1 cm，右側股四頭肌無明顯變化;2號兔左右兩側股四頭肌均輕度充血，其范圍小于0.5 cm×1 cm。根據刺激反應中反應級的分值計為分3，結果見表1。鏡檢見肌纖維組織橫紋清晰，結構基本完整，部分區域見局灶性出血，未見炎細胞浸潤以及肌纖維的變性壞死。

表1 肌肉刺激反應分級結果

2.3 小鼠急性毒性試驗結果

2.3.1 口服試驗結果 經食管灌入煙酸黃藤素注射液30 min后，部分小鼠開始出現藥物反應，第3組至第5組小鼠活躍程度不如第1組，采食量比第1組明顯減少，但飲水量增加，部分昆明小鼠表現出興奮不安，痙攣，縮成一團，呼吸困難，昏迷，4 h后開始出現死亡。到第7 d，存活小鼠采食、飲水正常，活動自如。死亡小鼠剖檢，外形未見異常，剖檢發現，肺臟輕微充血，支氣管淤血，粘液較多;胃粘膜充血、水腫，腸系膜充血;脾臟腫大，邊緣鈍圓，肝臟表面呈暗紫紅色，切面呈暗紅色，質地變軟;心臟充盈，輕微水腫。用改良寇氏法計算得出LD50為 2866 mg/kg，LD5095% 可信限為 2455～3346 mg/kg(表2)。

表2 小鼠口服急性毒性試驗結果

2.3.2 腹腔注射試驗結果 各組小鼠按劑量注射煙酸黃藤素注射液后，部分小鼠10 min開始出現藥物反應，第3組至第5組小鼠活躍程度不如第1組，飲水量增加，部分小鼠躬腰縮背，卷縮起來，活動減少，痙攣，呼吸困難，昏迷，約30 min后第5組開始出現死亡。到第7 d，存活小鼠采食、飲水正常，活動自如。死亡小鼠剖檢，外形未見異常，剖檢發現，肺臟輕微充血，支氣管淤血，粘液較多;腸系膜充血;脾臟腫大，邊緣鈍圓，肝臟表面呈暗紫紅色，切面呈暗紅色，質地變軟;心臟充盈，輕微水腫;輸尿管有白色尿酸鹽沉積。用改良寇氏法計算得出LD50為 153 mg/kg，LD5095%可信限為 117～199 mg/kg(表3)。

表3 小鼠腹腔注射急性毒性試驗結果

3 討論

為了制備有效藥物濃度更高、物理性狀穩定性更好、臨床使用更為方便的黃藤素注射液，本研究篩選性質穩定、毒性低、對動物機體無危害的煙酸作助溶劑，成功制備3%煙酸黃藤素注射液。本試驗對煙酸黃藤素注射液的溶血性、肌肉刺激性和急性毒性進行了試驗。在溶血與凝集試驗中，煙酸黃藤素注射液0.1～0.5 mL在3 h內對兔紅細胞不產生溶血和凝聚作用，說明煙酸黃藤素注射液符合注射液溶血與凝集試驗標準，與李群力等［5］發現黃藤素葡萄糖注射液在體外對家兔紅細胞不產生溶血及凝集作用的研究結果相一致。在肌肉刺激性試驗中，2只試驗兔4塊股四頭肌反應級總和為3，按照2只試驗兔4塊股四頭肌反應級之和小于10時，則認為供試品的局部刺激試驗符合規定的標準判斷，3%煙酸黃藤素注射液局部刺激反應輕微，肌肉刺激試驗符合規定。在小鼠口服和腹腔注射急性毒性試驗中，按照Karber法計算出LD50分別為2866 mg/kg、153 mg/kg;楊榮等［6］研究結果表明，黃藤素注射液Beagle犬靜脈給藥近似致死劑量接近50 mg/kg，本試驗煙酸黃藤素注射液腹腔注射小鼠近似致死劑量接近75 mg/kg，考慮靜脈注射和腹腔注射給藥途徑的差異，說明煙酸黃藤素注射液與黃藤素注射液比較毒性未明顯增強。按照LD50在1 mg/kg以下者為極毒，1～50 mg/kg為劇毒，50～500 mg/kg為中等毒，500～5000 mg/kg為低毒，5001～15000 mg/kg為實際無毒，＞15000 mg/kg為無毒標準判斷，煙酸黃藤素口服給藥屬低毒性藥物，注射給藥屬中等毒性藥物。以上試驗對煙酸黃藤素注射液安全性和毒性進行了綜合評價，為進一步進行臨床治療試驗提供了藥理毒理學基本依據。

黃藤素是我國自行研制的純天然植物藥，1977年首次收載于《中華人民共和國藥典》［7］，現收載于《中華人民共和國藥典》2010年版一部“植物油脂和提取物”部分［4］，《獸藥國家標準(化學藥品、中藥卷)第一冊》也收載了獸用黃藤素注射液質量標準［8］，黃藤素在醫學、獸醫臨床均具有應用基礎。但是，黃藤素以植物提取物形式入藥，其藥理毒理基礎研究相對比較薄弱，系統性研究鮮有資料報道;相反，時有黃藤素致過敏性休克、藥疹、腹痛、大便潛血、唾液腺腫大、肺水腫等臨床不良反應報道［2］。因此，在開發黃藤素相關制劑的同時，應加強黃藤素藥理毒理學基礎研究，為臨床應用提供更為全面的科學依據。

［1］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典2010年版一部［S］.

［2］楊小良，謝麗莎，龔志強.黃藤素的研究綜述［J］.中國醫藥指南，2009，7(17):42－44.

［3］國家食品藥品監督管理局.［Z］GPT4－1.中藥、天然藥物刺激性和溶血性研究的技術指導原則［S］.2005.

［4］農業部獸藥評審中心.獸藥研究技術指導原則匯編(2006－2011年)［S］.2013.北京:化學工業出版社，2012:84－87.

［5］李群力，陳 菲.黃藤素葡萄糖注射液安全性實驗研究［J］.中草藥，2007，38:252－253.

［6］楊 榮，陸 瑛，張 玲，等.黃藤素注射液Beagle犬靜脈給藥毒性觀察［J］.四川生理科學雜志，2005，27(1):48.

［7］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典1997年版一部［S］.

［8］中國獸藥典委員會.獸藥國家標準(化學藥品、中藥卷)第一冊［M］.北京:中國農業出版社，2013:41.