HPLC－PDAD法檢測3種中獸藥散劑中違規添加4種喹諾酮類藥物的研究

劉自揚，董玲玲，范 強，王 雷，萬仁玲

(中國獸醫藥品監察所，北京，100081)

中獸藥散劑的治療作用通常見效較慢，某些獸藥生產者為提高療效、占領市場而在中獸藥散劑中違規添加化學藥物，而養殖企業在不知情的情況下使用含有化學藥物的“中獸藥”，必然導致濫用藥物的現象發生，產生不可預知的動物性產品中獸藥殘留超標，易誘發細菌耐藥性，直接關乎動物源性食品的安全。本研究建立的反相高效液相色譜法簡便、快速、準確，可用于肥豬散、健胃散、銀翹散3種中獸藥散劑中違規添加的氧氟沙星、諾氟沙星、環丙沙星、恩諾沙星4種喹諾酮類藥物的檢測。

1 材料

1.1 儀器 Waters 2695e高效液相色譜儀，配有二極管陣列檢測器PDA2996、自動進樣器和Empower 2工作站;分析天平XS205型，梅特勒－托利多儀器(上海)有限公司;超聲波處理器KQ300江蘇昆山超聲波儀器有限公司。

1.2 藥品與試劑 氧氟沙星、諾氟沙星、環丙沙星(鹽酸鹽)、恩諾沙星對照品，均來自中國獸醫藥品監察所;磷酸為分析純，三乙胺、甲醇、乙腈為色譜純。

2 方法與結果

2.1 樣品制備 自制中藥散劑:按獸藥典中肥豬散、健胃散、銀翹散處方［1］規定的藥材及配比，自行粉碎、混合均勻;模擬樣品:參考氧氟沙星、諾氟沙星、環丙沙星、恩諾沙星與對應散劑的臨床用量［2－3］，按添加比例 = 化藥臨床用量/中藥臨床用量計算確定添加比例為1%，取自制中藥散劑，按1%添加測試藥物［4］，研勻，即得。

2.2 色譜條件與系統適應性 采用Waters Atlantis?T3 4.6 mm ×250 mm，5 μm(十八烷基硅烷鍵合硅膠)色譜柱。以磷酸溶液(磷酸3.0 mL加水1000 mL，用三乙胺調pH值至3.0±0.1，加乙腈53 mL，搖勻，即得)為流動相A;乙腈為流動相B;甲醇為流動相C;按 A∶B∶C 為 85.5∶7.0∶7.5 進行洗脫。二極管陣列檢測器，采集波長范圍為200～400 nm;分辨率為1.2 nm。氧氟沙星與諾氟沙星色譜峰分離度應大于1.5，結果見圖1。因四種喹諾酮類藥物中氧氟沙星與諾氟沙星較難完全分離，實現了以等度洗脫的方式使氧氟沙星與諾氟沙星色譜峰完全分離，則這四種喹諾酮類藥物色譜峰的分離度就能夠符合要求［5－6］，結果見表1。

圖1 氧氟沙星、諾氟沙星光譜及色譜圖

表1 氧氟沙星、諾氟沙星系統適應性結果

2.3 線性范圍 取測試藥物12.5 mg，加2%磷酸溶液 －乙腈(1∶1)50.0 mL，量取 1.0、3.0、5.0、7.0、9.0 mL分別置25 mL量瓶中，加流動相 A至刻度，搖勻。各取10 μL注入液相色譜儀，同時記錄光譜圖和283 nm波長處的色譜圖。以對照品濃度(X)為橫坐標，峰面積(Y)為縱坐標，進行線性回歸，結果見表2。

表2 四種喹諾酮類藥物線性結果表

2.4 回收率 取自制散劑1.25 g，分別精密加入測試藥物10、12.5、15 mg，分別加 2%磷酸溶液 －乙腈(1∶1)50.0 mL，超聲處理 15 min，稍放置，濾過，各取濾液 2.0 mL，加流動相 A 至 10.0 mL，搖勻，濾過。每個濃度各制備3份平行樣，各取10 μL注入液相色譜儀，同時記錄光譜圖和283 nm波長處的色譜圖。結果見表3。

表3 回收率試驗結果表

2.5 檢出限 對照品工作溶液:取測試藥物12.5 mg，加2%磷酸－乙腈(1∶1)適量超聲使溶解并稀釋至刻度，搖勻;精密量取2 mL，置50 mL量瓶中，用流動相A稀釋至刻度，搖勻 (10 μg/mL)。散劑溶液:自制散劑1.25 g，置50 mL具塞錐形瓶中，加2%磷酸－乙腈(1∶1)50 mL，超聲15 min，濾過，即得。檢出限測試溶液:分別取散劑溶液和對照品工作溶液，用流動相A稀釋至被測藥物的濃度分別為0.5、1、2 μg/mL。取檢出限測試溶液 10 μL 注入液相色譜儀，同時記錄光譜圖和283 nm波長處的色譜圖。以光譜圖不失真的濃度作為檢出限［4］，測得氧氟沙星、諾氟沙星、環丙沙星、恩諾沙星分別在銀翹散、健胃散、肥豬散中的檢出限均為200 mg/kg。

2.6 供試品測定 取模擬樣品1.25 g，加2%磷酸溶液－乙腈(1∶1)50.0 mL，超聲15 min使溶解，各取2.0 mL，加流動相 A 至10.0 mL，搖勻，濾過，得供試品溶液。分別取供試品溶液、對照品工作溶液、散劑溶液各10 μL注入液相色譜儀，同時記錄光譜圖和283 nm波長處的色譜圖［7］。結果顯示，3種散劑在4種喹諾酮類藥物出峰處無干擾，供試品溶液色譜峰和對照品溶液相應色譜峰保留時間及光譜圖一致。

3 討論與分析

3.1 目標化合物的選擇 喹諾酮類藥物能通過干擾DNA、RNA及蛋白質的合成而起殺菌作用。農業部批準的喹諾酮類藥物［5，8］有9種，分別是:氧氟沙星、諾氟沙星、甲磺酸培氟沙星、環丙沙星、洛美沙星、甲磺酸達氟沙星、恩諾沙星、沙拉沙星、二氟沙星等(不同的鹽不重復計算)，其中以氧氟沙星、諾氟沙星、環丙沙星、恩諾沙星4個喹諾酮類藥物應用最為廣泛，因此也常常成為不法中獸藥生產企業為提高產品療效而添加的藥物。試驗選擇常用的肥豬散、健胃散和銀翹散為目標散劑，選擇氧氟沙星、諾氟沙星、環丙沙星、恩諾沙星為測試藥物。

3.2 提取溶劑的選擇 由于中藥成分復雜，為減小其本底對測定的干擾，應盡可能增加提取溶劑中乙腈的比例［4］，但測試藥物的溶解度又隨著乙腈比例的增加而減小。因此，初步選定流動相A與乙腈的混合溶液作為提取溶劑，進行回收率試驗，結果偏低，且RSD偏高。遂又采用不同濃度的三乙胺溶液與乙腈的混合溶液，以及不同濃度的磷酸溶液與乙腈的混合溶液分別作為提取溶劑進行回收率試驗，最終發現水相中的三乙胺是導致回收率結果偏低的原因。最終確定提取溶劑為2%磷酸溶液－乙腈(1∶1)。

3.3 色譜條件的選擇 喹諾酮類藥物的母體結構相同，理化性質極為相似，因此僅選擇乙腈作為有機相不能實現完全分離［9］。考慮到乙腈較甲醇的反相洗脫強度大，故在流動相中加入適量甲醇，以此來降低反相洗脫強度，達到分離選擇性微調的目的。再對水相、乙腈和甲醇進行三因素三水平正交設計，最終確定流動相比例，研究之初以實現9種喹諾酮類藥物的色譜分離為目標，還考察了梯度洗脫程序，最終實現了9種藥物的有效分離。在此研究基礎上，變梯度洗脫為等度洗脫，建立了實現氧氟沙星、諾氟沙星、環丙沙星、恩諾沙星有效分離的色譜條件。

3.4 峰純度檢查 本法在對中獸藥散劑中違規添加氧氟沙星、諾氟沙星、環丙沙星、恩諾沙星檢查時，除了通過對比中獸藥散劑中未知色譜峰與四種喹諾酮類藥物的出峰時間和光譜數據進行定性外，還使用Empower工作站檢查四種喹諾酮類藥物相應色譜峰的純度。結果表明四種喹諾酮類藥物的純度角度均小于閾值，根據Waters色譜工作站的色譜峰純度理論，可認為四種喹諾酮類藥物色譜峰均是單一物質峰，方法可行。

4 小結

試驗建立了檢查中獸藥散劑中違規添加氧氟沙星、諾氟沙星、環丙沙星、恩諾沙星這四種喹諾酮類藥物的反相高效液相色譜法。以銀翹散、肥豬散和健胃散為目標散劑，驗證了本方法準確靈敏。實際檢查中，只需將樣品與四種對照的色譜及光譜圖進行比對，即可進行判斷。

［1］中國獸藥典委員會編.中華人民共和國獸藥典二○一○年版二部［S］.

［2］中國獸藥典委員會編.中華人民共和國獸藥典獸藥使用指南化學藥品卷［S］.

［3］中國獸藥典委員會編.中華人民共和國獸藥典獸藥使用指南中藥卷［S］.

［4］劉自揚，萬仁玲，馬長華，等.HPLC－PDAD/MS法檢測中獸藥散劑中違規添加2種喹喔啉二氧化物的研究［J］.世界科學技術－中醫藥現代化，2011，13(5):878－884

［5］中國獸藥典委員會編.中華人民共和國獸藥典二○一○年版一部［S］.

［6］中國藥典委員會編.中華人民共和國藥典二○一○年版二部［S］.

［7］中華人民共和國廣東出入境檢驗檢疫局.進出口食品中農獸藥殘留實用檢測方法［S］.

［8］中國獸藥典委員會編.國家獸藥標準(化學藥品、中藥卷)第一冊［S］.

［9］于慧娟，畢士川.反相離子對液相色譜法同時測定11種氟喹諾酮類藥物的研究［J］.分析實驗室，2007，12(26):23－26.