湖北漢族人2型糖尿病與Calpain10基因多態性的相關研究

謝瓊 盧月月 易宏鋒

2型糖尿病(T2DM)是由遺傳因素及環境因素共同作用而形成的多基因遺傳性復雜疾病，是一組異質性疾病［1］。相關研究報道人群中發現的第1個增加T2DM遺傳易感性的是Calpain 10基因，位于2號染色體長臂上的NIDDM1區［2-3］。Calpain 10基因和歐美人群的 T2DM的遺傳易感性有關聯［4-5］。本文探討T2DM基因中的SNP43及SNP19這2個多態性位點與漢族人群T2DM遺傳易感性之間的關系，報道如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選擇我院2009年1月至2012年12月T2DM患者262例為試驗組，男161例，女101例，年齡25～72歲，平均(60.7±10.9)歲;血糖正常者262例為對照組，男112例，女150例，年齡25～72歲，平均(50.1±9.4)歲。T2DM患者入院后經相關血清學測定證實抗胰島細胞抗體(ICA)和抗谷氨酸脫羧酶抗體(GAD)陰性。T2DM診斷采用國際上通用的WHO糖尿病專家委員會(1999)提出的診斷和分類標準。對照組來自我院體檢中心篩選出的健康體檢者，共262例，經口服糖耐量試驗(OGTT)除外糖尿病患者，排除糖尿病家族史者。

1.2 試驗方法

1.2.1 DNA的提取和擴增:采用石蠟包埋組織DNA提取技術進行抽提組織DNA。提取物可直接用作模板，進行PCR擴增。Calpain 10基因第3個內含子內包含SNP43多態性和SNP19多態性的DNA片段。SNP43引物序列F:CAC GCT TGC TGT GAA GTA ATGC;R:CTC TGA TTC CCA TGG TCT GTA G;SNP19引物序列F:GTT TGG TTC TCT TCA GCGTGG AG;R:CAT GAA CCC TGG CAG GGT CTAAG。

1.2.2 多態性的檢測:SNP43多態性的檢測采用PCR-RFLP方法，PCR產物經Nsi1內切酶經37℃水浴16h消化后，行6%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，銀染后讀取基因型。SNP19多態性的檢測采用PCR產物直接行6%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，銀染后讀取基因型。

1.3 統計學處理 所有數據通過SPSS 13.0統計軟件包進行統計學分析，2組間率的比較采用卡方檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 基因型分析 SNP43多態性的PCR產物長度為151 bp，此序列內單個堿基的G-A突變使ATGCGT變為ATGCAT，PCR產物可被酶解成121個堿基和23個堿基的2個片段。電泳后在DNA標準分子量參照物142 bp附近出現條帶的基因型為野生型純合子GG，在142 bp與102 bp之間出現條帶的基因型為突變的純合子AA，同時在2個部位均出現條帶的基因型為雜合子GA。任選4份樣品測序，與實驗結果相符。

2.2 基因多態性分析 SNP43多態性和SNP19多態性的等位基因在各組研究對象中的分布比較分析顯示，試驗組與對照組相比，SNP43位點等位基因G頻率顯著升高(P＜0.05)，GG基因型頻率亦顯著升高(P＜0.05)，見表1。SNP19位點等位基因，見表2。

表1 2組SNP43位點等位基因及基因型頻率的比較

表2 2組SNP 19位點等位基因及基因型頻率的比較

3 討論

3.1 SNP位點基因易感性 在國內的湖北漢族人群T2DM的研究試驗中，T2DM的發病風險與CDKAL1、CDKN2A/B等基因上的若干個SNP位點呈顯著相關性。IGF2BP2和SLC30A8基因上的遺傳變異，會增加空腹血糖受損的風險［6-8］。糖尿病相關數量性狀分析結果顯示，這些易感SNP位點與空腹血糖、糖化血紅蛋白水平，尤其是與胰島B細胞功能之間存在很強的相關性。這些在中國漢族人群中發現的SNP位點，對T2DM的發病風險具有疊加性。目前，已經報道的T2DM基因易感位點有近60個，但是絕大多數都是在歐美和其他亞洲人群中發現的［9-10］。我國近30年來T2DM的患病率逐年快速增加，現有研究表明包括中國漢族人群在內的東亞人群對T2DM的易感性顯著高于西方人群，但是其遺傳學基礎尚不清楚。

3.2 G/A多態性與糖尿病 本研究中T2DM患者與對照組相比，SNP43位點等位基因(G)和基因型(GG)的頻率顯著升高，說明湖北漢族人群基因中SNP43位點G/A多態性與T2DM發病相關，此項研究結果與國內外的報道相符。除此之外，本研究提示，SNP19等位基因位點的G/A基因和GG基因型在T2DM中分布頻率和正常對照組相比，無顯著差異，提示Calpain 10基因的SNP19位點等位基因頻率與T2DM患者的發病不相關。

目前，國內外未見有關IRE1a基因變異性與糖尿病風險的關聯研究報道，也未見關于IRE1a與IGR發病機制的研究。推測其可能的機制為:己知IRE1a是影響UPR通路的重要信號分子，有研究觀察到與IGR風險或胰島素分泌水平相關的SNP可能影響基因mRNA的表達，從而影響蛋白的表達或蛋白的功能，進而干擾胰島B細胞，促進B細胞凋亡，影響胰島素分泌的功能，雖然相關SNPs均位于內含子［11-13］。但有研究證實內含子具有調節基因(如Calpain 10)表達的作用;其次，它們有可能只是一個遺傳標記，可能存在與其呈高度連鎖不平衡的影響IRE1a mRNA或蛋白表達的成因變異。增齡本身是糖尿病的風險因素，隨著年齡的增長胰島B細胞的功能進行性下降，因此，從機制上年齡和風險等位基因在對胰島B細胞功能的影響上有協同作用，共同參與糖尿病的易感性［14］。

這些研究成果不僅為解析與T2DM易感性相關的致病基因的結構、基因功能和生物學機制、種族間的差異奠定了堅實的基礎;而且該項目所建立的人群數據庫和生物樣本庫也將為揭示調控致病基因的主要營養和其他環境因素，發展和建立對高危個體的預測模型提供了研究平臺。本項目的完成對建立符合中國人特點的T2DM的早期風險評估體系和個體化干預策略，推動我國在該領域的研究進入國際前沿，具有重要意義。

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