microRNA過表達載體構建技術的實驗研究

姜 彬

（北京大學 醫學部生化系，北京 100191）

1 microRNA概述

1993年，Lee等［1］在線蟲中發現了小分子單鏈非編碼RNA，其長度只有22nt，當時命名為1in－4。這種RNA能夠通過堿基配對結合到靶mRNAlin－14的3’末端非翻譯區（3’untransIational region，3’UTR），抑制1in－14的翻譯，導致1in－4或lin－14的突變，從而造成線蟲發育差時表型（heterocllronlc phenotype）。2000年Reinhart等［2］又發現了另一個類似的具有轉錄后調節功能的小分子RNA：let－7。兩者都被發現具有卓越的時序調節功能，因此被命名為小時序RNA（stRNA）。之后stRNA被歸入了 microRNA家族中。2001年不同國家的研究小組分別在線蟲、果蠅和人體中發現了這類長度為21～22nt的非編碼小分子RNA［3］，將其命名為 microRNA（簡寫為 miRNA）。在以后幾年的時間里，許多實驗室相繼發現了更多的miRNA，其家族成員的數量不斷擴大［4］。miRNA在自然界廣泛存在于人體、線蟲、果蠅、家鼠、擬南芥等多種動植物中，它沒有編碼功能，但在腫瘤的發生，細胞凋亡與衰老過程中起著關鍵的作用，其功能還涉及到生物體的正常發育、免疫調控、組織修復、干細胞的自我更新等生理過程。miRNA由于其分子小卻具有非常卓越的基因轉錄表達和細胞周期的調控作用而成為各國分子生物學家研究的熱點。

本實驗所涉及到的microRNA－21（簡寫為miR－21）已被發現在多種血液系統和實體器官的惡性腫瘤中發揮重要作用，也是目前發現的唯一一個在實體腫瘤中過表達的miRNA。Ciafre等［5］利用microarray的方法檢測了惡性膠質瘤組織中245種microRNAs的整體表達水平，其中miR－21的表達水平明顯上調。Chan等［6］通過對原代培養建立的6種多形性惡性膠質瘤細（A172、U87、U373、LN229、LN428、LN308）、正常胎兒和成人腦組織以及體外培養的正常的神經膠質細胞進行比較分析，也發現在惡性膠質瘤中miR－21的表達水平大幅度升高。進一步研究表明，在培養的惡性膠質瘤細胞中下調 miR－21的表達，可以觸發caspases的激活，從而導致腫瘤細胞的凋亡。這些研究表明，miR－21的異?？赡苁峭ㄟ^抑制關鍵性的凋亡相關基因的表達而促進惡性腫瘤的形成。此外，Iorio等［7］比較了乳腺癌及正常乳腺組織miR－21的表達，通過microarray和Northern印跡法驗證了miR－21在乳腺癌組織中表達上調，表明miR－21可能在乳腺癌惡性腫瘤形成中也扮演著癌基因的角色。近年來，大量的文獻報道證實了miR－21是一種致癌基因，但它的作用機制仍然不是十分清楚。到目前為止，獲得詳細描述的miR－21的靶信號通路主要有程序性細胞死亡因子4（PDCD4）［8］、原肌球蛋白1（TPMI）［9］、磷酸酯酶－張力蛋白同源物（PTEN）這3種，這幾條靶信號通路僅僅限于部分腫瘤組織中，并不能推廣到所有腫瘤組織。miR－21還可以通過作用于一個復雜的腫瘤抑制信號通路來發揮其致癌作用，包括如p53信號通路［10］等。我們看到，在絕大多數的腫瘤細胞中都存在有miR－21的上調，因此miR－21與抑癌基因的關系及其作用機制越來越受到關注。本實驗所要構建的miR－21載體正是為了進一步研究miR－21的功能之用的，也是研究的第一步工作。

對于miRNA表達載體構建方法的選擇，目前有兩種策略：一種策略基于miRNA／siRNA表達載體，利用統一表達框的miRNA過表達技術；另一種策略是從人類基因組DNA中用PCR方法擴增出miRNA的前體序列，酶切后定向插入真核表達載體，構建miRNA真核表達載體pcDNA3.1（＋）－microRNA。轉染細胞后在載體啟動子作用下轉錄為具有“莖環”結構的pre－microRNAs，通過胞內自身的RNA聚合酶ⅢDicer的作用剪接加工成為成熟的microRNAs，從而發揮對靶基因的調控作用?？紤]到由于細胞分化是一個過程，研究微小RNA在其中的調控的作用需要有一定的觀察時間，而pcDNA3.1（＋）真核表達載體含有CMV啟動子，AMP、neo抗性基因以及BGH polyA加尾信號和SV40早期啟動子（見圖1），可以在大多數哺乳動物細胞中得到穩定表達。因此在構建miR－21表達基因時我們試采用了pcDNA3.1（＋）真核表達載體。

圖1 pcDNA3.1（＋）真核表達載體圖譜

2 試劑

2BS細胞（人肺成纖維細胞）由我校衰老研究中心存種，于實驗前復蘇培養；過表達質粒載體選用pcDNA3.1（＋）真核表達載體，Lipofectamine 2000 Reagent購自lnvitrogen公司；PCR引物由奧科生物公司合成；PCR反應體系購自康潤生物公司；限制性內切酶BamHⅠ和EcoRⅠ訂購于NEB公司；瓊脂糖凝膠回收試劑盒購自BioTeke公司；感受態細胞Dh5α購自博邁德科技公司；基因測序由華大基因公司完成。

3 實驗方法

（1）首先，查找pubmad的人類基因組數據庫，顯示miR－21基因位于17q23.1，即位于該染色體的16571687－16571758bp，基因序列如下：

按照構建miRNA的要求，在基因miR－21所在位置上下游各延長約200bp，即基因組中定位于17號染色體16571500—16571999bp的片段，得到如下序列：

序列中黑體加粗序列為與上下游引物匹配的序列部分；下劃線序列為pre－miR－21（miR－21前體）對應基因組序列部分；雙下劃線序列為成熟miR－21所對應的基因組序列部分。

（2）PCR擴增目的基因。使用DNA抽提試劑盒提取2BS細胞（人肺成纖維細胞）基因組DNA，利用PCR技術將上述片段從基因組DNA上擴增下來，所用PCR引物為（5’段分別帶有限制性內切酶BamHⅠ和EcoRⅠ的識別序列）：

反應條件為：94 ℃、3min，94 ℃、30s，60 ℃、30s，72℃、45s，30個循環。

（3）電泳。將得到的PCR產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，進行PCR產物分析。

（4）回收目的基因。電泳后，使用膠回收試劑盒回收目的基因片段。

（5）酶切反應。分別用限制性內切酶BamHⅠ和EcoRⅠ對回收的目的片段和pcDNA3.1（＋）質?？蛰d體進行酶切。目的片段40μL酶切體系：回收的DNA片段30μL；10×緩沖液4μL；100×BSA 0.4 μL；限制性內切酶 2μL；去離子水3.6μL。pcDNA3.1（＋）質?？蛰d體20μL酶切體系：質粒載體5 μL；10×緩沖液4μL；100×BSA0.2μL；限制性內切酶1μL；去離子水9.8μL。酶切反應過夜。純化回收酶切過后的目的片段和質?？蛰d。

（6）連接反應。將上述的500bp的目的片段插入到質粒pcDNA3.1（＋）的限制性內切酶的BamHⅠ和EcoRⅠ位點上。即將已酶切的目的基因片段與質?？蛰d進行連接。10μL的連接反應體系：純化回收的已酶切質粒2μL；純化回收的已酶切的目的基因片段6μL；T4DNA連接酶1μL；10×T4DNA連接酶緩沖液1μL，連接反應過夜。

（7）轉化。將得到的連接產物轉化到感受態細胞Dh5α中，操作均按無菌條件的標準進行。

（8）篩選。在超凈工作臺中從各轉化平板上用已滅菌牙簽挑取飽滿勻稱的菌落，將其置于事先已加入適量LA液體培養基的搖菌管中，將搖菌管置于搖床上，37℃搖菌過夜。

（9）從轉化細菌中提取重組質粒。采用GenStar公司的StarPrep快速質粒小提試劑盒進行小提，采用MN公司的Plasmid DNA Purification（NucleoBond Xtra Midi／Maxi）試劑盒進行酶切鑒定后的大提。其原理均是基于堿裂解提取質粒的方法，并結合硅膠膜吸附技術，使質粒DNA獲得高效、專一的吸附，進而洗脫獲取重組體。

（10）酶切鑒定。采用限制性內切酶BamHⅠ和EcoRⅠ進行雙酶切，酶切反應體系為20μL雙酶切反應體系：提取的重組質粒5μL；10×緩沖液2μL；限制性內切酶BamHⅠ1μL；限制性內切酶EcoRⅠ1μL；去離子水11μL。酶切反應30min后，將酶切產物進行瓊脂糖凝膠電泳分析。

（11）測序。將重組質粒送華大基因公司測序，經DNA測序證實，目的基因片段已成功構建到pcDNA3.1（＋）真核表達載體中。

（12）RT－PCR。將重組質粒和空載體轉染入Hela細胞進行培養，而后提取RNA，進行RT－PCR（反轉錄聚合酶鏈式反應）實驗。由于miRNA過于短小，因而采用了特殊的逆轉錄引物序列，以下黑體加粗的序列為與miR－21互補的序列：

PCR體系一般為20μL，包含合成的cDNA模板2 μL，特異性引物1μL，10mM dNTP 1μL，1uTaqDNA聚合酶1μL，25mMMgc 12μL。共進行25個循環，每個循環包含95℃變性20s，56～60℃退火1min，72℃延伸30s。對于miR－21模板使用miR－21的RT產物，內參GAPDH的模板使用cDNA。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳分離，用凝膠成像系統進行分析。

4 結論

4.1 miR－21PCR擴增結果

miR－21PCR擴增產物電泳結果顯示見圖2。圖2中左側為不同溫度下，以2BS細胞基因組DNA為模板進行PCR得到的產物條帶，擴增產物均在大約500 bp處泳出條帶，與用于構建過表達載體的miR－21基因片段大小的理論值相符。圖中右側為DNA mark。

圖2 miR－21PCR擴增結果

4.2 重組質粒酶切鑒定結果

對從隨機選擇的2個菌落中所提重組質粒進行雙酶切，然后進行瓊脂糖凝膠電泳，結果見圖3。圖3左側為挑出的2個單克隆菌落進行搖菌，小提質粒，BamHⅠ和EcoRⅠ（NEB）雙酶切，將酶切產物進行瓊脂糖凝膠電泳得到的條帶?？梢妰烧呔境?個條帶，一條在約5 kbp處，另一條在約500bp處，分別與pcDNA3.1（＋）真核表達載體和所需miR－21片段大小相一致。

圖3 重組質粒酶切鑒定結果

4.3 miR－21過表達載體轉染腫瘤細胞后miR－21的表達情況

利用構建好的miR－21真核表達載體和空載體轉染Hela細胞，培養后提取RNA進行RT－PCR實驗。結果顯示，轉染了miR－21真核表達載體的細胞與轉染空載體的細胞相比，其miR－21的表達量顯著提高（見圖4）。證實miR－21過表達載體的構建是準確有效的，構建工作是成功的，為下一步研究miR－21的作用機制及其功能奠定了基礎。

圖4 microRNA－21RT－PCR表達水平

5 結論

本實驗成功構建了miR－21過表達載體，實驗證實，這種利用真核載體構建microRNA過表達載體的方法符合microRNAs的一般生物合成過程和作用原理，經濟、簡便、高效和準確，效果穩定，重復性好，符合實驗需要。構建好的過表達載體可轉染細胞（腫瘤細胞或衰老細胞），可通過實時PCR方法［11］檢測其轉錄情況，可通過Western blot［12］檢測細胞中蛋白質表達的變化，進一步研究miR－21的作用機理。

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