基于不同煙堿轉化株鑒別標準的白肋煙品種改良效果

孫紅戀，周海燕，王瑞云，宋瑩麗，孫軍偉，王新中，軒書章，史宏志

1 河南農業大學煙草學院/國家煙草栽培生理生化研究基地,鄭州,450002；

2云南省煙草公司大理州公司,云南,大理671000;

3云南煙草賓川白肋煙有限責任公司,云南,賓川671600

基于不同煙堿轉化株鑒別標準的白肋煙品種改良效果

孫紅戀1，周海燕1，王瑞云1，宋瑩麗1，孫軍偉2，王新中2，軒書章3，史宏志1

1 河南農業大學煙草學院/國家煙草栽培生理生化研究基地,鄭州,450002；

2云南省煙草公司大理州公司,云南,大理671000;

3云南煙草賓川白肋煙有限責任公司,云南,賓川671600

為明確不同轉化株鑒別標準的科學性,探討基于不同轉化株鑒別標準的白肋煙品種改良效果。在采用不同煙堿轉化株鑒別標準對TN86進行改良的基礎上,對不同改良種的煙葉經濟性狀、煙堿轉化率和TSNAs含量進行比較分析。結果表明,以煙堿轉化率低于2.5%作為選擇標準得到的改良種1（PNC＜2.5）煙堿轉化率穩定,上部葉比常規種低37.7%,中部葉低38.3%；總TSNAs含量低,比常規種低17.9%；產量、產值及上中等煙比例也明顯優于其他改良種,且后代變異系數最小。改良種2（PNC＜3）和改良種3（PNC＜5）的煙堿轉化性狀分離明顯,TSNAs含量較高。綜合來說,煙株煙堿轉化率2.5%作為區別轉化株和非轉化株的標準較為可靠,選擇PNC＜2.5的煙株進行留種或制種可以保證后代群體中出現轉化株的頻率最低,能夠更有效地降低降煙堿含量和煙草特有亞硝胺的形成和積累,提高煙葉的香味品質。

煙堿轉化株；鑒別標準；白肋煙；品種改良;煙草特有亞硝胺

煙堿是白肋煙的重要化學成分,其含量高低和煙葉品質及可用性有十分密切的關系[1-2]。普通煙草屬于煙堿積累型,其煙堿含量占總生物堿含量93%以上,但在栽培品種的煙株群體中,一些煙株會因為基因突變而形成煙堿去甲基能力,導致煙堿含量顯著降低,降煙堿含量相應增加[3-4]。煙堿向降煙堿轉化可顯著影響煙葉香味品質,并促進煙草特有亞硝胺之一亞硝基降煙堿的形成和積累[5-9],從群體中去除轉化株是降低煙葉和產品中TSNAs 含量及提高和改善煙葉香味品質的有效途徑。煙堿轉化的發生是顯性突變的結果,煙堿轉化是顯性基因控制,并具有加性效應[10-11],因此品種材料轉化株的多少和煙堿轉化率高低將直接影響后代表現。煙堿轉化主要發生在白肋煙的調制階段,通過遺傳改良途徑去除煙堿轉化株,必須在開花前對留種煙株或親本材料進行轉化性狀誘導,并根據生物堿分析結果和煙堿轉化率進行轉化株的鑒別［12］。國外曾把煙堿轉化率大于5%作為轉化株的標準,后來修改為大于3%作為標準,但研究中發現一些煙堿轉化率低于3%的煙株自交后代仍出現顯著的煙堿轉化性狀分離,近期研究表明,煙堿轉化率高于2.5%作為轉化株的鑒別標準具有更大的科學性,且煙堿轉化率低于2.5% 的煙株在不同葉位間和葉點間比較穩定,而煙堿轉化率高于2.5% 的煙株表現出葉位間和葉點間的較大變異,而且自交后代仍會出現煙堿轉化性狀的分離[13-14]。本研究基于不同的煙堿轉化株鑒別標準對云南白肋煙主栽品種TN86進行遺傳改良,旨在明確不同轉化株鑒別標準的科學性、改善煙葉品質和降低TSNA含量,為白肋煙品質育種和品種改良提供依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料和地點

本試驗分別于2011年和2012年在云南省賓川縣進行。2011年對主栽品種TN86進行轉化株早期誘導,按不同轉化株鑒別標準得到改良種和株系,分別為TN86改良種1（PNC＜2.5）、TN86改良種2（PNC＜3）、TN86改良種3（PNC＜5）、高轉化株系1（5＜PNC＜20）、高轉化株系2（PNC＞20）。

2012年設置田間試驗對不同改良種和株系進行農藝性狀、化學成分和品質性狀的比較。以當地白肋煙主栽品種TN86常規種作為對照。試驗田面積0.2 hm2,前茬為水稻,地勢平坦,排灌方便,肥力中等,種植密度16500株/hm2。

1.2 試驗方法

2011年在TN86移栽后30 d定株編號,每株取中下部葉1片煙葉進行轉化株的誘導[13],摘取煙葉后,均勻噴施0.3%乙烯利(2-氯乙基磷酸)水溶液,充分濕潤,后保濕晾制4 d,待煙葉充分變黃后,將葉片烘干磨碎,測定煙堿和降煙堿含量,計算煙堿轉化率。

將所有測定煙株套袋自交,所獲種子按測定的煙堿轉化率采用不同的標準將種子混合形成上述3個改良種和兩個株系。于2012年按常規方法進行育苗,5月10日移栽。對比試驗采用隨機區組設計,重復3次。移栽后30d,在每個改良種和株系中隨機選取20株掛牌編號,每株摘取中下部葉1片,采用乙烯利進行煙堿轉化誘導,以使具有煙堿轉化能力的植株在早期表達煙堿轉化性狀,測定煙堿轉化率的株間分布。

煙葉成熟后,整株砍收,統一掛在白肋煙標準晾房里晾制。晾制結束后,采收不同改良種和株系與兩個對照的上部葉和中部葉的煙樣進行混合樣品常規化學成分、生物堿、TSNA含量的測定。

1.3 化學成分測定

生物堿：樣品在60 ℃下烘干粉碎,過60目篩,稱取0.1 g煙葉樣品,用無水乙醚萃取,加0.5 mL 2NAOH潤濕,再加5 mL乙醚振蕩1 h提取生物堿；氣相色譜儀為Agilent-6890,檢測器為FID,具體操作和參數設定按Burton等[15]的方法進行。轉移上清液1 mL于色譜瓶中,用氣相色譜儀進行煙堿、降煙堿、假木賊堿和新煙堿含量分析。煙堿轉化能力用煙堿轉化百分率表示,即降煙堿含量占煙堿和降煙堿含量之和的百分比：

煙堿轉化百分率（%）=[降煙堿含量/(煙堿含量+降煙堿含量)]×100

TSNA測定：樣品送至美國肯塔基大學測定,測定方法為氣相色譜-熱能分析聯用儀(TEA),具體參數按Burton等[15]方法進行。

常規成分測定：煙葉總氮、還原糖、鉀、氯等含量采用德國BRAN+LUEBBE公司制造的AA3型流動分析儀測定。

1.4 數據分析與處理

運用SPSS17.0和Excel統計軟件進行數據的處理和分析。

2 結果與分析

2.1 TN86常規種植的煙堿轉化率分布

圖1是白肋煙品種TN86常規種植的煙株間煙堿轉化率的分布圖,其煙堿轉化率的變異范圍為1.245%～40.115%。變異系數為154.98%,煙株間煙堿轉化率變異較大,說明白肋煙TN86在種植過程中煙堿轉化性狀分離明顯,出現較高比例的煙堿轉化株。

表1是2011年TN86常規種進行煙堿轉化率測定后,按照不同的轉化株鑒別標準得到的3個改良種和兩個株系及平均煙堿轉化率。由表1可知,按照2.5%作為區分轉化株和非轉化株鑒別標準得到的TN86改良種1（PNC＜2.5）平均煙堿轉化率最低,為1.73%。

圖1 TN86自然群體單株煙堿轉化率分布Fig.1 Distribution of nicotine conversion ratio for individual plants of TN86

表1 TN86改良種及株系母代煙堿轉化率范圍及平均煙堿轉化率Tab.1 Range of nicotine conversion ratio and average nicotine conversion ratio of parental plants of improved TN86 varieties and high converter lines

2.2 不同改良種和株系早期誘導后煙堿轉化率株間分布

2.2.1 TN86改良種1（PNC＜2.5）煙堿轉化率的株間分布

由圖2可知,改良種1的煙堿轉化率變異幅度為1.00%～9.43%,變異系數為49.58%,煙堿轉化性狀分離不明顯,表明煙堿轉化率在小于2.5%之間的煙株性狀穩定,僅有少量低轉化株出現。

圖2 TN86改良種1（PNC＜2.5）煙株煙堿轉化率的株間分布Fig.2 Distribution of nicotine conversion ratio for individual plants of improved TN86-1(PNC＜2.5）

2.2.2 TN86改良種2（PNC＜3）煙堿轉化率的株間變異和分布

由圖3可知,改良種2煙堿轉化率變異幅度為1.52%～16.07%,變異系數為91.93%,煙堿轉化性狀分離突出,表明煙堿轉化率低于3%的煙株群體中存在轉化株。

圖3 TN86改良種2（PNC＜3）煙株煙堿轉化率的株間分布Fig.3 Distribution of nicotine conversion ratio for individual plants of improved TN86-2 (PNC＜3）

2.2.3 TN86改良種3（PNC＜5）煙堿轉化率的株間分布

由圖4可知,改良種3的煙堿轉化率變異幅度為1.702%～45.931%,變異系數為128.18%,變異系數較高,性狀分離明顯,表明群體中含有一定數量的轉化株,后代群體中可分離出不同程度的轉化株。

圖4 TN86改良種3（PNC＜5）煙株煙堿轉化率的株間分布Fig.4 Distribution of nicotine conversion ratio for individual plants of improved TN86-3 (PNC＜5）

2.2.4 高轉化株系1（5＜PNC＜20）煙株煙堿轉化率的株間分布

為了驗證轉化株的分離規律, 研究中選擇了高轉化株進行對比試驗。高轉化株系1（5＜PNC＜20）煙株煙堿轉化率的株間分布如圖5,其煙堿轉化率變異幅度為1.73%～57.41%,變異系數為118.88%,煙堿轉化性狀分離相對明顯,且不同程度轉化株呈連續分布,其中包含一定數量的高轉化株。

圖5 高轉化株系1（5＜PNC＜20） 煙株自交后代煙堿轉化率的株間分布Fig.5 Distribution of nicotine conversion ratio for individual plants of TN86 high converter line 1 (5＜PNC＜20）

2.2.5 高轉化株系2（PNC＞20）煙株自交后代煙堿轉化率的株間分布

由圖6可知,高轉化株系2的煙堿轉化率變異幅度為3.93%～89.84%,變異系數為43.92%,變異系數較低,煙堿轉化性狀分離不明顯,表明煙堿轉化率PNC＞20的煙株性狀較穩定,后代煙株均為轉化株。

圖6 高轉化株系2（PNC ＞20）煙株自交后代煙堿轉化率的株間分布Fig.6 Distribution of nicotine conversion ratio for individual plants of TN86 high converter line 2 (PNC＞20）

2.3 TN86不同改良種和株系轉化株和非轉化株比例

由表2可以得出,TN86改良種1（PNC＜2.5)群體中非轉化株比例為80%,低轉化株比例為20%,平均煙堿轉化率為2.07%（小于2.5%）,煙株的性狀穩定。TN86改良種2（PNC＜3)和TN86改良種3（PNC＜5)種植的后代群體中出現大量低轉化株,煙堿轉化性狀較不穩定,后代分離出現轉化株的比例較高。高轉化株系1（5＜PNC＜20)非轉化株比例占15%,平均煙堿轉化率為12.65%。TN86高轉化株系2（PNC＞20)在種植的后代中全為轉化株,低轉化株的比例僅占10%,平均煙堿轉化率62.67%。TN86改良種1與改良種2、3差異性不顯著,與高轉化株系1和2差異性顯著。

表2 白肋煙不同改良種和株系的轉化株鑒定結果Tab.2 Identification results of converter from improved varieties and high converter lines

2.4 調制后不同改良種和株系經濟性狀分析比較

從表中可以看出改良種1（PNC＜2.5)的產量最高。改良種1（PNC＜2.5)的產值較高,高轉化株系2（PNC＞20)的產值最低。TN86不同改良種和株系與TN86常規種的上等煙比例、中等煙比例以及均價之間差別較小。不同改良種和株系的中等煙比例表現為差異性不顯著。不同改良種和株系的產值和產量之間表現為差異性顯著。從表3中可以看出,TN86改良種1（PNC＜2.5)優于其他的改良種和株系。

表3 白肋煙TN86改良種和株系與TN86常規種經濟性狀的比較分析Tab.3 Comparison of economic characters between TN86 regular variety and improved varieties and high converter lines

2.5 調制后不同改良種和株系化學成分分析比較

從表4可知,上部葉的還原糖,各個品種間均在適宜范圍內,以改良種2（PNC＜3.0)最大；煙堿含量存在較大差異,改良種1（PNC＜2.5)顯著高于TN86常規種和高轉化的株系,這是因為改良種的煙堿轉化性狀得到了改良,煙堿轉化株減少,煙堿轉化率降低。不同改良種和株系間總氮含量、Cl含量和K含量變化差異較小。不同改良種和株系間的上部葉煙堿含量多表現為差異性顯著。中部葉的還原糖和總氮明顯大于上部葉的含量；中部葉煙堿含量明顯低于上部葉。

表4 白肋煙不同改良種和株系與TN86常規化學成分的比較Tab.4 Comparison of chemical components between TN86 regular variety and improved varieties and high converter lines

2.6 調制后不同改良種和株系的煙堿轉化率分布

由圖7、8可知,以PNC＜2.5作為轉化株的標準進行品種改良得到的改良種煙堿轉化率最低,上部葉比常規種降低1.36個百分點,降低37.7%,中部葉比常規種降低1.37個百分點,降低38.3%。以PNC＜3和PNC＜5為轉化株標準進行品種改良,所得到的改良種煙堿轉化率也較對照種相應降低,但降低的幅度相對較低。改良種1與改良種2和改良種3的上部葉和中部葉的煙堿轉化率差異性不顯著,同高轉化株系差異性顯著。所選擇的高轉化株系的調制后煙葉煙堿轉化率處于較高水平,且與轉化株系的基礎水平密切相關。

圖7 白肋煙改良種和株系調制后上部葉煙堿轉化率比較Fig.7 Comparison of nicotine conversion ratios among cured upper leaves of different improved varieties and lines

圖8 白肋煙改良種和株系調制后中部葉煙堿轉化率比較Fig.8 Comparison of nicotine conversion ratios among cured middle leaves of different improved varieties and lines

2.7 不同改良種和株系調制后煙葉TSNAs含量比較

由表5可知,TN86常規種TSNA總量為3.001μg/g,以NNN含量最高,NAT含量其次（表5）。TN86改良種1（PNC＜2.5)的總TSNA含量最低,比常規種降低 17.9%, 其次為 TN86改良種 2（PNC＜3.0)。總TSNA含量的降低主要是由NNN含量的降低引起的,兩個TN86改良種比常規種NNN含量分別降低34.3%和27.9%。TN86改良種1的TSNA總含量與改良種2和改良種3差異不顯著,與高轉化株系1、高轉化株系2和TN86常規種（CK）差異性顯著。因此,通過嚴格選擇煙堿轉化率低的非轉化株進行留種,可以顯著降低后代群體中煙堿轉化株比例和煙堿轉化率,進而降低NNN和總TSNA含量。

3 討論

煙堿轉化是白肋煙生產中的突出問題,特別是我國不少白肋煙品種由于在品種選育和種子繁育過程中沒有進行降煙堿含量的測定和選擇, 所以群體中存在大量轉化株,直接造成香味品質下降和煙草特有亞硝胺含量增加,對煙葉品質和煙葉安全性造成不利影響。煙堿轉化是隱性基因向顯性基因突變造成的,NtabCYP82E4位點在轉錄上的重新激活使其在衰老葉片中產生煙堿去甲基形成降煙堿[16]。因此,煙堿轉化性狀可在群體中不斷積累,對栽培品種進行系統改良十分必要。

在煙株生長早期階段進行轉化株和非轉化株的鑒定對于品種改良是必需的,科學制定區分轉化株和非轉化株的標準至關重要,在前期研究中,我們通過不同煙堿轉化率與新煙草堿/降煙堿比值的關系以及具有不同煙堿轉化率煙株自交后代的表現提出了煙堿轉化率2.5%可以作為區分轉化株和非轉化株的標準[13-14],在本研究中,我們首次將該標準應用到對白肋煙TN86的改良中,并與采用其它標準得到的改良種進行比較,通過對不同改良種煙堿轉化株的比例和轉化程度分布、調制后煙葉樣品化學成分、煙堿轉化率、煙草特有亞硝胺含量等的分析,表明以煙堿轉化率2.5%作為區分轉化株和非轉化株的標準進行品種改良是科學和有效的。改良種1（PNC＜2.5）后代變異系數小,煙株性狀穩定,其化學成分和經濟性狀明顯優于其它改良種。改良種1（PNC＜2.5)上部葉煙堿含量顯著高于TN86常規種和高轉化的株系,這是因為改良種的煙堿轉化性狀得到了改良,煙堿轉化株減少,煙堿轉化率降低。調制后改良種1（PNC＜2.5)的總TSNA含量最低,比常規種降低17.9%。改良種2（PNC＜3）和改良種3（PNC＜5）的后代株間變異大,煙堿轉化性狀分離明顯,表明這兩個改良種群體中仍含有一定比例的轉化株,因此不能達到最佳的改良效果。雖然在改良種1的群體中仍出現個別低轉化株,這可能是由于煙葉在進化過程中形成的非轉化基因很不穩定,所以經過嚴格選擇的非轉化株群體后代仍會出現一定比例的轉化株[10]。因此對品種的選擇和改良不是一勞永逸的,需要持續進行。

4 結論

采用煙堿轉化率2.5%作為區分轉化株和非轉化株的標準,嚴格選擇煙堿轉化率低于2.5%的煙株進行留種或制種可以保證后代群體中出現轉化株的頻率最低,從而更有效地降低降煙堿含量和煙草特有亞硝胺的形成和積累,提高煙葉的香味品質。

[1]史宏志, 張建勛.煙草生物堿[M].北京: 中國農業出版社,2004: 1-11.

[2]Bush L P, Fannin F F, Chelvarajan R L, et al.Biosynthesis and Metabolism of Nicotine and Related Alkaloids [M]// Corrod J W, Wahren J, eds.Nicotine and Related Alkaloids.London: Chapman & Hall, 1993: 101-128.

[3]史宏志 李進平 Bush L P,等.煙堿轉化率與卷煙感官評吸品質和煙氣TSNA含量的關系[J].中國煙草學報,2005(11)2:9-14.

[4]史宏志,李進平, Bush L P, 等.白肋煙雜交種及親本煙堿轉化株的鑒別 [J].中國煙草學報, 2005,11(4):28-31.

[5]史宏志, Bush L P, Krauss M.煙堿向降煙堿轉化對煙葉麥斯明和TSNA 含量的影響[ J].煙草科技, 2004 (10) : 27-30.

[6]Bush L P, Cui M W, Shi H Z, et al.Formation of tobacco specific nitrosamines in air-cured tobacco [J].Rec Adv Tob Sci, 2001, 55:23-46.

[7]史宏志, 李進平, Bush L P, 等.煙堿轉化率與卷煙感官評吸品質和煙氣TSNA 含量的關系[J].中國煙草學報, 2005,11(2) : 9-14.

[8]史宏志, 凌愛芬, 劉國順, 等.白肋煙煙堿轉化對煙葉中性和堿性香氣成分含量的影響[J].華北農學報, 2007, 22( 5) :43-46.

[9]Shi H Z, Kalengamaliro N E, Hemp fling W P, et al.Difference in nicotine conversion between lamina and midrib in burley tobacco and its contribution to TSNA formation[C]/ / 56th Tobacco Science Research Conference, Lexington, KY, USA, 2002.

[10]Wernsman E A, Davis D L, Beeson D.Genetic instability at a nicotine to nornicotine locus in burley tobacco and its consequences on secondary amine alkaloids and TSNAs [C].CORESTA, Lisbon, Portugal, 2000.

[11]Chelvarajan R L, Fannin F F, Bush L P.Study of nicotine demethylation in Nicotiana otophora [J].J Agric Food Chem,1993, 41: 858-862.

[12]Shi H Z, Fannin F F, Burton H R, et a1.Identification of nicotine to nornicotine converters in burley tobacco[C]//55thTobacco Science Research Conference, Greensboro, NC, USA, 2001.

[13]史宏志,趙永利,楊興有,等.白肋煙不同類型轉化株煙堿轉化率的葉位間和葉點間變異［J］.中國煙草學報,2009,15(5):28-32.

[14]趙曉丹,史宏志,楊興有,等.白肋煙不同程度煙堿轉化株后代煙堿轉化率株間變異研究[J].中國煙草學報, 2012,18(1):29-34.

[15]Burton H R, Bush L P, Djordjevic M V.Influence of temperature and humidity on accumulation of tobacco-specific nitrosamines in stored burley tobacco [J].J Agric Food Chem, 1989, 37: 1372-1377.

[16]Gavilano L B, Coleman L P, Burnley L, et al.Genetic engineering of Nicotiana tabacum (L.) for reduced nornicotine content [J].J Agric Food Chem, 2006,54(24): 9071-9078.

Improvement effect of burley varieties based on identification standard of different nicotine converter

SUN Honglian1, ZHOU Haiyan1, WANG Ruiyun1,SONG Yingli1,SUN Junwei2, WANG Xinzhong2, XUAN Shuzhang3, SHI Hongzhi1
1National Tobacco Cultivation & Physiology & Biochemistry Research Center, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, China;
2 Yunnan Dali Tobacco Company, Dali 671000, China;
3Binchuan Burley Tobacco Co.Ltd., Binchuan 671600, China

Different improved TN86 varieties with different screening standards for identifying nicotine converter and non-converters were compared for economic character, nicotine conversion ratio, and content of TSNAs.Results showed that the improved variety 1(PNC＜2.5)with nicotine conversion ratio of less than 2.5% as benchmark was more stable with ratio of upper tobacco 37.7% lower than conventional breed and 38.3% lower for middle part tobacco.Total content of TSNAs was 17.9% lower than conventional breed, and yield, output value and the proportion of middle and superior tobacco were better than other improved varieties with the lowest variable coefficient.The separations of nicotine conversion characters of improved variety 2(PNC＜3) and improved variety 3(PNC＜5) were significant, and the content of TSNAs was higher.Generally speaking, there was reliable difference between converter and no-converter with nicotine conversion ratio of 2.5%.Choosing tobacco with PNC＜2.5 can ensure lower ratio of appearance of converted plant, and more effectively reduce formation and accumulation of nornicotine and TSNAs, thereby improving aroma quality.

nicotine converter; identification standard; burley; variety improvement; TSNAs

10.3969/j.issn.1004-5708.2014.03.009

S572.01 文獻標志碼：A 文章編號：1004-5708（2014）03-0056-07

云南省煙草公司科技項目“賓川優質白肋煙技術開發與應用”(2011YN36)

孫紅戀（1987—）,在讀碩士,主要從事煙草栽培和生理研究,Email:sunhongluan1987@163.com

史宏志（1963—）,博士,教授,博士生導師,主要從事煙草栽培和生理研究,Email:shihongzhi88@163.com

2013-07-03