乳鼠成纖維細胞在人血清中的存活與增殖的研究

肖揚+李裕舒+董平栓

【摘要】 目的：本研究旨在證明人血清直接培養乳鼠成纖維細胞是可行的。方法：將乳鼠成纖維細胞分別在胎牛血清及人血清中培養，通過在顯微鏡下觀察成纖維細胞形態及密度，同時用MTT比色法檢測吸光度來對比成纖維細胞在胎牛血清及人血清中的增殖活性。結果：兩種實驗方法均顯示：兩組成纖維細胞在第一天的增殖活性無顯著性差異，第四天人血清組的成纖維細胞增殖明顯比胎牛血清組活躍。結論：乳鼠成纖維細胞在人血清中不僅可以存活，而且有增殖行為。

【關鍵詞】 成纖維細胞； 人血清

Observation on Surviving and Proliferation of Neonatal Rat Fibroblasts in Human Serum/XIAO Yang， LI Yu-shu，DONG Ping-shuan.//Medical Innovation of China，2014，11（31）：015-017

【Abstract】 Objective： To prove that human serum directly is feasible to culture rat fibroblasts. Method： Rat fibroblasts were cultured in serum and fetal bovine serum， by observing the morphology and density of fibers under a microscope， and with the MTT ratio test to compare the absorbance of cells into proliferative activity in serum and fetal bovine serum. Result： There was no significant difference between two groups in the first day； but the fibroblasts proliferation rate in human serum was higher than in fetal bovine serum. Conclusion： Neonatal rat fibroblasts in human serum can survive and proliferate in human serum.

【Key words】 Fibroblast； Albumin Human

First-authors address： The First Affiliated Hospital of Henan University of Science and Technology， Luoyang 471003， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2014.31.005

成纖維細胞是結締組織中常見的細胞，由胚胎時期的間充質細胞分化而來，細胞扁平，多突起，呈梭形、三角形、不規則形，它參與人體的纖維化過程。過度纖維化會導致器官形態及功能的異常，心臟的纖維化可導致心臟擴大、心衰、心律失常等[1]，因此心臟纖維化是目前心臟研究的熱點。研究過程中常會用到成纖維細胞，但限于成纖維細胞的取材限制，常用實驗動物的細胞，多用動物血清培養[2]，但用人血清直接培養的卻很少。本研究旨在證明人血清直接培養乳鼠心臟成纖維細胞的可行性，為成纖維細胞在人體中的增殖研究提供依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料 乳鼠（SD大鼠）；胰酶1：250（Amresco公司生產）；膠原酶B型（Roche公司生產）；DMEM高糖培養基（Gibico公司生產）；噻唑藍MTT（Sigma公司生產）；二甲基亞砜DMSO（Amresco公司生產）；倒置顯微鏡（Olympus公司生產，型號IX74 TH4-200）；酶標儀（BIO-TEK公司生產，型號ELX 800）。實驗分組：選擇胎牛血清組為對照組；選擇正常人15例為實驗組，年齡（57.0±1.3）歲。

1.2 方法

1.2.1 實驗材料處理方法

1.2.1.1 實驗血清處理方法及原代培養液制備 將無菌促凝管中抽取的成人動脈血，置于4 ℃溫度下1 h，待血液凝固后，離心（3000轉/min）10 min，取上清置于離心管中，實驗用的胎牛血清從試劑公司購回，在無菌超凈臺中將其分裝至無菌小瓶中看，置于-20 ℃冰箱中凍存備用。每次使用時將其置于室溫下完全溶解即可使用。將處理好的人或胎牛血清加入達爾伯克（氏）改良伊格爾（氏）培養基，血清濃度為10%，有研究顯示血清濃度為10%～15%時，成纖維細胞生長良好[3]，放置于無菌超凈臺中用濾膜微孔為0.22微米的一次性濾器濾過除菌，制備成原代培養液，按照100 U/mL的濃度加入雙抗（分別將青霉素和鏈霉素用無菌蒸餾水完全溶解后制成的溶液）以抑制培養過程中細菌的生長，防止細胞被污染，置于-20 ℃冰箱中凍存備用。

1.2.1.2 乳鼠心臟成纖維細胞的分離培養步驟 在超凈臺中，取乳鼠（出生3 d以內）心臟，剪碎后用雙酶消化（2.5 g/L胰酶+1 g/L膠原酶），第一次消化10 min后棄上清，從第二次開始每次消化5 min，將上清轉移到含有原代培養液的無菌離心管中，直至將組織消化完畢，離心（1000轉/min）10 min，棄上清，加入培養基混勻，分裝在50 mL培養瓶中，置于溫度為37 ℃，CO2濃度為50 mL/L的培養箱中，兩小時后棄去上清，將分離出的成纖維細胞分為二等分，分別用含有胎牛血清和人血清的原代培養液進行培養，隔日換液。每個樣本換液均用其原代培養液。體外成纖維細胞在培養容器的典型存活和生長方式是貼壁和增殖，貼壁成纖維細胞在光學顯微鏡下觀察為梭形、三角形或不規則形，有較長的偽足樣突起。endprint

1.2.2 實驗結果獲得方法

1.2.2.1 顯微鏡下觀察步驟：將培養容器放置在倒置顯微鏡（Olympus公司生產，型號IX74TH4-200）下選擇細胞輪廓清晰的視野進行照相記錄。

1.2.2.2 檢測成纖維細胞增殖的MTT（噻唑藍）比色法步驟：取生長狀態良好的細胞用2.5 g/L的胰酶消化，在顯微鏡下見細胞變圓，棄去胰酶，加入原代培養液吹打，吹打完畢后轉移至無菌96孔板中繼續培養，每孔約4000個細胞，200 μL培養液。連續6 d檢測結果，檢測當天，每孔加入5 ?L MTT，放入溫度為37 ℃，CO2濃度為50 mL/L的培養箱繼續培養4 h，棄去上清，每孔加入150 ?L的二甲基亞砜，10 min搖勻后，以570 nm為測量波長，在酶聯免疫檢測儀上測每孔的光吸收值（OD），以不加細胞的空白孔OD值作調零值，并以時間為橫軸，光吸收值為縱軸繪制曲線。

1.3 統計學處理 各組計量資料用（x±s）表示，數據分析用配對t檢驗，統計處理使用軟件SPSS 13.0完成，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 倒置顯微鏡（×200）下，成纖維細胞形態結果 傳代后，在倒置顯微鏡（×200）下觀察成纖維細胞形態及密度，A、C為FCS所培養，B、D為HFS所培養。第1天兩種含不同血清培養基培養的成纖維細胞形態相似，呈梭形或三角形，有較長偽足樣突起，且密度大致相同，如圖1中A、B所示。第4天兩種含不同血清培養基培養的成纖維細胞相似，呈梭形、三角形或不規則形，但密度不同：含FCS培養基培養出的成纖維細胞密度大于含HFS培養基的，見圖1中C、D。與第1天相比，每種培養基培養細胞的密度均比同種在第1天觀察到的密度大。

2.2 吸光度與時間關系 根據每日檢測結果繪制細胞增殖的吸光度與時間關系曲線。（圖表中數據為細胞增殖的吸光度值，為各組各樣本每天吸光度值的均數。從圖中可以看出，兩組細胞吸光度均隨培養天數的增加呈上升趨勢，其中牛血清組的上升趨勢快于人血清組，見圖2。

圖1 第二代成纖維細胞倒置顯微鏡下形態

圖2 細胞增殖的吸光度與時間關系曲線圖

2.3 兩組吸光度的比較結果 兩組吸光度在第1天比較，差異無統計學意義；第4天兩組吸光度比較差異有統計學意義，且牛血清組吸光度高于人血清組，見表1。

表1 三組MTT檢測細胞吸光度值（x±s）

組別 第1天 第4天

FCS組 0.012±0.010 0.182±0.013△

HFS組 0.008±0.002 0.156±0.033*

*與FCS組相比較，P<0.05；△與HFS組相比較，P<0.05

3 討論

成纖維細胞是結締組織中常見的細胞，由胚胎時期的間充質細胞分化而來。電鏡下可看到胞質中有豐富的粗面內質網、游離的多核糖體和發達的高爾基復合體，表明該細胞合成蛋白質的活動旺盛，在正常情況下，這種細胞多處于靜止狀態，功能活動不活躍，成為纖維細胞，而在創傷等條件下可被炎癥介質趨化，進入增殖活化狀態，成纖維細胞可以合成和分泌彈性纖維、網狀纖維等細胞外基質成分[4]，同時還可合成和分泌金屬蛋白酶及其抑制劑，間接參與舊膠原的降解和新膠原的重排、沉積，參與受損組織的纖維性修復即纖維化過程，然而，過度的纖維化使器官及組織喪失原有的形態或功能[5-6]。因此，纖維化的發生發展成為研究的熱點，成纖維細胞成為該類研究不可或缺的研究部分，心臟纖維化是目前心臟疾病研究的熱點，心臟的纖維化不僅能造成心臟結構、功能的異常，導致心臟擴大進而出現心力衰竭[7]，也由于心臟成纖維細胞的電生理學特性造成心律失常[8]，由于在人類活體上獲取心臟組織細胞有一定難度，而且可能會對受試者造成不可知的傷害，因此本研究選取出生3 d以內的乳鼠心臟作為成纖維細胞的來源器官，利用在同一培養皿中心肌細胞與成纖維細胞貼壁時間的不同分離出心臟成纖維細胞[9]。目前的科學研究中，多用動物血清來培養細胞，其培養的細胞存活率較高、分裂增殖活動比較活躍[10]，而關于成年動物血清尤其是人類血清培養的成纖維細胞是否出現類似現象的研究甚少，而選擇人類血清直接培養細胞要比動物血清培養細胞之后再進行相關的干預更具說服力。

在倒置顯微鏡下，成活的乳鼠心臟成纖維細胞呈梭形、三角形或不規則形，細胞質透明、向外伸出突起呈偽足樣，細胞核大，呈橢圓形，無自發性搏動，顯微鏡下可直接看到成活乳鼠成纖維細胞的形態及密度。MTT比色法是一種常用的檢測細胞存活和生長的方法，其檢測原理為活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍紫色結晶甲瓚并沉積在細胞中，而死細胞無此功能。二甲基亞砜能溶解細胞中的甲瓚，用酶聯免疫檢測儀在490 nm或570 nm波長處測定其光吸收值，可間接反映活細胞數量。在一定細胞數范圍內，MTT結晶形成的量與活細胞數成正比。

本研究將人血清和胎牛血清培養乳鼠心臟成纖維細胞的結果進行對比，第1天鏡下觀察到的含兩種不同血清培養基培養的成纖維細胞密度無明顯差異（見圖1的A、B）且MTT結果中吸光度無顯著差異（見表1），說明第1天時成纖維細胞處在一個適應過程，到第4天時每種培養基培養細胞的密度均比同種在第1天觀察到的密度大（見圖1的C、D），且在培養的頭4天，MTT結果顯示吸光度都隨時間呈增長趨勢（見圖2），這說明兩種培養基培養的成纖維細胞均已存活，且有數量上的增加，即有分裂增殖行為。在第二代細胞培養第4天以后，兩種不同培養基培養的成纖維細胞經MTT法檢測的吸光度都有下降的趨勢，提示成纖維細胞的數量有所下降，這可能跟培養的空間有限，限制了細胞的增殖。綜合以上鏡下觀察以及MTT吸光度的結果可以發現，乳鼠心臟成纖維細胞在胎牛血清培養基中可存活并分裂增殖，在人血清培養基中顯示了同樣的趨勢。對比兩組結果，成纖維細胞在胎牛血清中生長更為活躍，可能與胎牛血清中含有更多的刺激細胞生長的細胞因子有關。實驗證明，乳鼠心臟成纖維細胞不僅可在人血清中存活，且有增殖行為，乳鼠成纖維細胞直接由人血清培養是可行的。雖然該實驗選取心臟成纖維細胞作為研究對象，但因成纖維細胞在動物各個器官廣泛存在，且生物學特性類似，故人血清直接培養其他器官來源的成纖維細胞亦是可行的，該研究為人類血清培養動物細胞的可行性提供了依據。endprint

參考文獻

[1]馬金，丁春華.心臟成纖維細胞與心肌纖維化[J].中華心血管病雜志，2014，42（3）：269-272

[2]劉愛旗，夏璐.CCK-8法與MTT法檢測兔成纖維細胞活性的比較研究[J].中國醫學創新，2013，10（2）：12-13.

[3]劉鵬，金巖，劉源，等.不同種屬真皮成纖維細胞在不同血清濃度培養基中生長的比較觀察[J].實用口腔醫學雜志，2004，20（1）：16-19.

[4] Wynn T A. Cellular and molecular mechanisms of fibrosis[J]. J Pathol，2008，214（2）：199-210.

[5] Brown J J， Bayat A. Genetic susceptibility to susceptibility to raised dermal scarring[J]. Br J Dermatol，2009，161（1）：8-18.

[6] Juckett G， Hartman-Adams H. Management of keloids and hypertrophic scars[J]. Am Fam Physician，2009，80（3）：253-260.

[7] Li Y Q， Li X B， Guo S J， et al. Apocynin attenuates oxidative stress and cardiac fibrosis in angiotensin Ⅱ-induced cardiac diastolic dysfunction in mice[J]. Acta Pharmacol Sin，2013，34（3）：352-359.

[8]邢曉倩，徐健，蘇浩，等.犬心房顫動模型縫隙連接蛋白40、45與心肌纖維化的相關性[J].中華心血管病雜志，2011，39（2）：176-180.

[9] Golden H B， Gollapudi D， Gerilechaogetu F， et al. Isolation of cardiac myocytes and fibroblasts from neonatal rat pups[J]. Methods Mol Biol，2012，843（1）：205-214.

[10]吳剛，何輝，曹月誠，等.不同血清培養條件下骨髓間充質干細胞的增殖[J].中國組織工程研究與臨床康復，2010，14（49）：9151-9154.

（收稿日期：2014-03-24） （本文編輯：王宇）endprint

參考文獻

[1]馬金，丁春華.心臟成纖維細胞與心肌纖維化[J].中華心血管病雜志，2014，42（3）：269-272

[2]劉愛旗，夏璐.CCK-8法與MTT法檢測兔成纖維細胞活性的比較研究[J].中國醫學創新，2013，10（2）：12-13.

[3]劉鵬，金巖，劉源，等.不同種屬真皮成纖維細胞在不同血清濃度培養基中生長的比較觀察[J].實用口腔醫學雜志，2004，20（1）：16-19.

[4] Wynn T A. Cellular and molecular mechanisms of fibrosis[J]. J Pathol，2008，214（2）：199-210.

[5] Brown J J， Bayat A. Genetic susceptibility to susceptibility to raised dermal scarring[J]. Br J Dermatol，2009，161（1）：8-18.

[6] Juckett G， Hartman-Adams H. Management of keloids and hypertrophic scars[J]. Am Fam Physician，2009，80（3）：253-260.

[7] Li Y Q， Li X B， Guo S J， et al. Apocynin attenuates oxidative stress and cardiac fibrosis in angiotensin Ⅱ-induced cardiac diastolic dysfunction in mice[J]. Acta Pharmacol Sin，2013，34（3）：352-359.

[8]邢曉倩，徐健，蘇浩，等.犬心房顫動模型縫隙連接蛋白40、45與心肌纖維化的相關性[J].中華心血管病雜志，2011，39（2）：176-180.

[9] Golden H B， Gollapudi D， Gerilechaogetu F， et al. Isolation of cardiac myocytes and fibroblasts from neonatal rat pups[J]. Methods Mol Biol，2012，843（1）：205-214.

[10]吳剛，何輝，曹月誠，等.不同血清培養條件下骨髓間充質干細胞的增殖[J].中國組織工程研究與臨床康復，2010，14（49）：9151-9154.

（收稿日期：2014-03-24） （本文編輯：王宇）endprint

參考文獻

[1]馬金，丁春華.心臟成纖維細胞與心肌纖維化[J].中華心血管病雜志，2014，42（3）：269-272

[2]劉愛旗，夏璐.CCK-8法與MTT法檢測兔成纖維細胞活性的比較研究[J].中國醫學創新，2013，10（2）：12-13.

[3]劉鵬，金巖，劉源，等.不同種屬真皮成纖維細胞在不同血清濃度培養基中生長的比較觀察[J].實用口腔醫學雜志，2004，20（1）：16-19.

[4] Wynn T A. Cellular and molecular mechanisms of fibrosis[J]. J Pathol，2008，214（2）：199-210.

[5] Brown J J， Bayat A. Genetic susceptibility to susceptibility to raised dermal scarring[J]. Br J Dermatol，2009，161（1）：8-18.

[6] Juckett G， Hartman-Adams H. Management of keloids and hypertrophic scars[J]. Am Fam Physician，2009，80（3）：253-260.

[7] Li Y Q， Li X B， Guo S J， et al. Apocynin attenuates oxidative stress and cardiac fibrosis in angiotensin Ⅱ-induced cardiac diastolic dysfunction in mice[J]. Acta Pharmacol Sin，2013，34（3）：352-359.

[8]邢曉倩，徐健，蘇浩，等.犬心房顫動模型縫隙連接蛋白40、45與心肌纖維化的相關性[J].中華心血管病雜志，2011，39（2）：176-180.

[9] Golden H B， Gollapudi D， Gerilechaogetu F， et al. Isolation of cardiac myocytes and fibroblasts from neonatal rat pups[J]. Methods Mol Biol，2012，843（1）：205-214.

[10]吳剛，何輝，曹月誠，等.不同血清培養條件下骨髓間充質干細胞的增殖[J].中國組織工程研究與臨床康復，2010，14（49）：9151-9154.

（收稿日期：2014-03-24） （本文編輯：王宇）endprint