白芍總苷對實驗性變態反應性腦脊髓炎大鼠腦組織IL-17含量影響的研究

陳俊先，李作孝

多發性硬化（Multiple sclerosis，MS）目前普遍認為是一種自身免疫功能異常的慢性疾病，以中樞神經系統（Central nervous system，CNS）白質炎性脫髓鞘為主要特點。病變可累及腦室周圍白質、腦干、小腦、脊髓、視神經等重要部位。MS 的具體發病原因及機制均有待進一步研究。目前更傾向認為MS 的發病機制與自身免疫反應相關。對MS 治療多采用皮質類固醇激素等免疫抑制劑抑制炎性脫髓鞘反應，起到抗炎和免疫調節的作用。但長期使用不良反應多。故發揮祖國中醫學的優勢，從中藥中發現對MS治療的有效成分值得進一步研究。白芍總苷（Total glucosidesofpaeony，TGP）是從中藥白芍根中提取的復合物，目前臨床已用于治療自身免疫性疾病如類風濕關節炎、干燥綜合癥、系統性紅斑狼瘡等。但TGP用于治療MS 的研究較少。實驗性自身免疫性腦脊髓炎（Experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE）模型其臨床表現與MS 相似，被公認是研究MS 的理想動物模型。本實驗通過制作大鼠EAE模型及TGP對發病大鼠的干預治療，探討TGP 對EAE 大鼠發病及腦組織IL-17含量的影響。

1 材 料

1.1 實驗動物 30只雌性大鼠，7～8周齡，體重180～220g；5 只豚鼠，體重400～450g。由瀘州醫學院實驗動物科提供。飼養均為統一鼠飼料及飲用水。喂養期間保證動物房的通風、清潔及溫度。

1.2 主要實驗試劑 氟氏完全佐劑（美國Sigma 公司）；IL-17 ELISA 試劑盒（深圳晶美生物工程有限公司）；白芍總苷膠囊（浙江寧波立華制藥有限公司）；中性甲醛固定液由病理教研室提供。

2 方 法

2.1 實驗動物分組 將統一飼養的30只雌性大鼠隨機分為三組，每組10 只，分別為正常對照組、EAE 對照組及TGP治療組。

2.2 建立EAE 模型［1］處死豚鼠后，無菌操作下快速剝離出其脊髓，去掉馬尾與脊膜，稱重后放入玻璃均漿器，加入生理鹽水研磨成50%勻漿，與等量福氏完全佐劑混合后裝入無菌玻璃注射器，并來回推動封好的注射器，反復抽打成油包水乳液，從而制得合格的EAE 造?？乖?。分別將所制的抗原以每只每側0.2ml 的劑量注入EAE 對照組和TGP 治療組大鼠雙后肢足掌皮下。正常對照組注射等劑量生理鹽水。

2.3 模型藥物干預 成功建立EAE模型后常規飼養各組。從造模當天開始，連續20 天TGP 治療組每日一次給予TGP180mg/（kg.d）灌胃，正常對照組及EAE對照模型組連續20天每日給予等量生理鹽水灌胃。

2.4 實驗動物神經功能評分及評分標準 于建模成功后第1天開始，每日上午10時由同一人單盲觀察發病情況，對各組大鼠行神經功能障礙評分。評分標準：0 分：無癥狀；1 分：后肢不全癱瘓；2 分：后肢完全癱瘓；3分：后肢全癱伴前肢不全癱；4分：四肢全癱或死亡；5分：趨于死亡。癥狀介于兩條標準之間者以±0.5分計。得分高說明神經功能受損重。

2.5 確定終止實驗時間 將出現連續3 天癥狀評分無加重、四肢癱瘓、死亡的發病大鼠時間作為EAE發病的高峰期，并在此時處死動物；未發病的動物觀察一月后處死。

2.6 大鼠腦組織IL-17含量的測定 實驗終止時，每只大鼠用生理鹽水灌注心臟后，逐層剝開大鼠枕頂部皮膚，用鑷子打開顱蓋骨，避免破壞腦組織。將生理鹽水與所取出腦組織按9:1的比例制成10%腦組織勻漿，然后采用固相夾心法聯免疫吸附實驗（ELISA）測定IL-17的含量。

2.7 統計學方法 統計學處理由SPSS 17.0 軟件完成。采用均數加減標準差（±s）表示各組實驗數據結果，采用t 檢驗進行兩組間樣本均數比較，采用LSD檢驗進行兩兩比較。

3 結果

3.1 發病情況 正常對照組大鼠精神活動可，體重正常增加。EAE對照組及TGP治療組發病動物表現為精神差、攝食活動減少、毛色暗淡、體重下降、共濟失調、癱瘓等，嚴重伴大小便失禁、抽搐、死亡等，但TGP治療組發病較EAE對照組癥狀輕。EAE對照組和TGP治療組發病潛伏期、進展期、高峰期癥狀評分見表1。

表1 各組發病潛伏期、進展期、高峰期癥狀評分比較（±s）

表1 各組發病潛伏期、進展期、高峰期癥狀評分比較（±s）

注：▼與EAE對照組比較，P＜0.01。

3.2 EAE對照組、TGP治療組及正常對照組大鼠IL-17水平變化，見表2。

表2 各組大鼠腦組織IL-17含量（±s）

表2 各組大鼠腦組織IL-17含量（±s）

注：▼與正常對照組比較，P＜0.01；★與EAE 對照組比較，P＜0.01。

從表2結果可以看出：EAE對照組和TGP治療組IL-17含量均高于正常對照組，差異具有統計學意義；EAE對照組和TGP治療組比較，TGP治療組IL-17含量明顯降低，差異具有統計學意義。

4 討論

目前認為MS是自身免疫性疾病，而細胞因子是在免疫系統疾病免疫應答中起重要作用。目前研究認 為TCD4+Th 細胞亞群主要分3 類：Th1、Th2、Th17。Th1 型細胞因子與EAE 發病相關，包括IL-1、IL-2、IL-6、TNF-α、INF-γ等；Th2 型細胞因子可抑制EAE 的發病，包括IL-10、IL-4 等。新發現的Th17 型細胞因子主要產生IL-17,IL-17是有很強促炎作用的細胞因子。IL-17 作為炎癥介質參與炎癥反應、自身免疫性疾病的發生和發展［2］，可以刺激靶細胞釋放炎癥細胞因子及動員中性粒細胞發揮作用，誘導IL-6、PGE2、NO 的產生，上調TNF-a、INF-r 的基因表達致炎癥進展。IL-17還可以提高CXC趨化因子表達，上調共刺激分子、主要組織相容復合物抗原等促進DC成熟，協同刺激T 細胞的活化；可通過信號轉導促進各因子的轉錄及蛋白合成。IFN-γ可在靶組織中持續較長時間，IL-17 峰在EAE 模型中出現在IFN-γ之前，因此IL-17、IFN-γ可能在誘導自身免疫性疾病中起協同作用［3］。EAE大鼠體內產生IL-17炎性細胞因子參與髓鞘破壞，直接作用內皮細胞破壞血腦屏障而進入中樞神經系統導致進一步脫髓鞘改變，引起EAE 病情加重。Th17 細胞在EAE 發病中也有不可或缺的作用。

白芍總苷（total glucosides of paeony，TGP）是從中藥白芍根中提取的復合物，其主要活性成分為芍藥苷。具有免疫調節、抗炎、鎮痛鎮靜、保護腦缺血等作用。近期也有一些關于TGP 針對IL-17 治療相關疾病的研究報道。其中任曉麗等［4］研究發現慢性蕁麻疹患者的血清中存在高水平的IL-4和IL-17。TGP可能通過影響Th2、Th17細胞相關因子來發揮治療慢性蕁麻疹的作用，經TGP 治療后其血清中IL-4 和IL-17明顯降低。賀勤等［5］研究發現TGP 能降低銀屑病皮損中IL-17的含量。TGP其對銀屑病的治療作用可能涉及對患者皮膚Th17細胞的影響。張宇虹等［6］研究發現TGP 可治療銀屑病。其機制可能與通過調節Th17細胞相關細胞因子IL-17和IL-23發揮治療銀屑病作用。劉國玲等［7］研究發現TGP能抑制佐劑關節炎大鼠的炎癥反應。其作用機制可能是TGP可降低炎性細胞因子IL-17 和血清VEGF 的產生，下調NFκB/p65蛋白的表達,最終抑制炎性細胞浸潤及血管增生。綜上可以得出TGP可以通過下調Th17細胞相關細胞因子IL-17 水平減輕炎癥反應，緩解相關癥狀有著重要作用。

目前國內多將白芍總苷用于治療類風濕關節炎、干燥綜合征、系統性紅斑狼瘡、強直性脊柱炎、糖尿病腎病、銀屑病等。而鮮有TGP用于EAE和MS方面的報道。而TGP對MS是否具有預防治療作用，同時對EAE 和MS 中IL-17 含量是否有影響，朱駿［8］觀察了TGP主要的藥物活性成分芍藥苷（pae oniflori，PF）對MOG EAE 小鼠模型的神經保護作用及其機制。研究結果發現PF 在MOG EAE小鼠模型中能夠緩解炎性脫髓鞘過程，改善臨床癥狀。機制與上調抑制性細胞因子、下調致炎性細胞因子、減低淋巴細胞增殖反應、上調CD4+CD25+調節性T 細胞、激動A1AR 而抑制神經炎性反應和發揮神經保護作用相關。

本實驗數據分析提示正常對照組大鼠未發病，EAE 對照組大鼠均出現不同程度的EAE 癥狀，故造模成功。通過各組大鼠的發病癥狀比較及對各組大鼠腦組織IL-17 含量測定可以得出以下結論:正常對照組大鼠腦組織勻漿中IL-17 的含量未升高，EAE 對照組、TGP 治療組大鼠腦組織勻漿中IL-17 的含量均明顯升高；TGP治療組大鼠發病晚、病情輕，腦組織勻漿中IL-17的含量也較EAE對照組低。說明IL-17有促進EAE 作用，抗IL-17 抗體能防止IL-17 在腦內的表達和EAE 的發生［9］。TGP 治療組大鼠的腦組織勻漿中IL-17的含量下降，則大鼠的EAE癥狀可得到明顯緩解。故對EAE具有明顯的保護作用。說明TGP可通過降低EAE 大鼠腦組織中的IL-17 水平來起到抑制EAE的作用。

Th17 型細胞因子主要產生IL-17，IL-17 對EAE發病起促進作用，故下調抑制IL-17分泌可對EAE起到防治作用。雖然TGP 在治療MS 還處于EAE 的實驗研究階段，但隨著對其治療機制及MS病因的深入研究。發揮TGP其抑制Th17型細胞因子等作用可能是MS臨床治療的一種新的選擇和方向。

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［6］張宇虹，郭在培.白芍總苷對輕、中度尋常性銀屑病患者血清中IL-17 和IL-23 的影響［J］.中國皮膚性病學雜志,2012,26（5）:391-392.

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