后肢制動對大鼠比目魚肌神經傳導功能的影響

趙雪紅，高艷，樊小力，唐一通

制動是臨床治療骨關節疾病的一種常用治療手段，然而制動在保護受損組織的同時，也會對周圍健康組織產生不利的影響。制動引起的最明顯變化是廢用性肌肉萎縮。正常的肌肉功能一方面依賴于骨骼肌自身結構的完整，更重要的是依賴于正常的神經支配。研究資料表明，在制動條件下神經系統的改變在廢用性肌萎縮發生中有著極其重要的作用，但以往的研究都集中在中樞神經的改變上[1-4]。迄今為止，很少有外周神經傳導功能改變方面的研究，尤其是感覺神經纖維的傳導功能。本研究擬采用電生理技術，觀察后肢制動條件下大鼠比目魚肌神經纖維傳導功能的改變，旨在揭示廢用性肌萎縮發生的機制，為進一步制定有效的防治肌萎縮的措施提供研究資料。

1 材料與方法

1.1 實驗動物分組

實驗選用24只健康雌性Sprague-Dawley大鼠，由西安交通大學醫學院實驗動物中心提供，體質量220～250 g。按體重配對原則隨機分為正常對照組、制動7 d組和制動14 d組，每組8只。所有實驗動物單籠喂養，能夠自由活動與進食、進水。室溫保持在20～25℃，人工控制動物室內照明，每晝夜均保持12 h光明與黑暗交替循環。

1.2 后肢制動模型的建立

制動組大鼠采用改良后Bobath等的方法建立大鼠后肢制動模型[5-6]。動物用水合氯醛0.4 g/kg腹腔注射麻醉，在其左側后肢的踝關節、膝關節及腹股溝等血管容易受壓處襯一層薄厚適宜的棉墊，然后用石膏繃帶由踝關節向上纏繞至大腿與腹股溝處，將動物后肢固定在縮短位。在石膏層的外面用一層銅網保護，以防止動物咬毀石膏。

1.3 手術及固定

動物經腹腔注射戊巴比妥鈉45 mg/kg麻醉，行常規氣管插管和頸靜脈插管術。將動物置于恒溫控制操作臺上，頭部固定于腦立體定位儀上，實驗開始后動物用箭毒制動行人工呼吸，頻率控制在75次/min，視動物呼吸幅度及狀態調節通氣量，整個實驗過程中用示波器連續監測動物心電(R-R間期維持在120～160 ms)，用溫控儀將體溫維持在37～38℃，隨時觀察動物瞳孔大小及皮膚色澤。

1.3.1 椎板切開術 沿正中線縱行切開皮膚，向兩側分開豎脊肌，切除第2至第1骶椎脊突及椎板，撕去硬脊膜及珠網膜，暴露腰骶脊髓，并辨認左側L4、L5、L6背根，做標記備用。最后拉起皮瓣，縫制油槽，內充37℃左右的液體石蠟加以保護。

1.3.2 比目魚肌及比目魚肌神經分離術 分離大腿后側肌與腓腸肌，暴露比目魚肌，從比目魚肌逆行分離比目魚肌神經至脛神經處，暴露坐骨神經主干及其主要分支。切斷比目魚肌神經以外的分支。

1.4 神經纖維動作電位傳導速度的測定

1.4.1 傳入神經傳導速度 在背根細束上置一單極鉑金絲電極，作為記錄電極；在比目魚肌神經上置一雙銀絲電極作為刺激電極。在記錄電極上引導比目魚肌肌梭單一細束傳入放電(CED 1401，英國CED公司)。測量該動作電位的潛伏期，作為該動作電位在刺激電極與記錄電極之間的傳導時間(t)。實驗結束后沿比目魚肌神經逆行分離神經纖維至記錄電極處的背根細束，用絲線測量該段神經纖維的長度，作為該動作電位在刺激電極與記錄電極之間傳導的距離(s)。按照公式V=s/t計算該動作電位的傳導速度(V)。

1.4.2 M波潛伏期 在比目魚肌遠側端的肌腱上用手術線結扎，離斷比目魚肌遠側端肌腱。測量比目魚肌最小生理長度(約為22.43±3.12 mm)和最大體內長度(約為28.45±4.17 mm)。最后制備下肢油槽，內充37℃左右的液體石蠟加以保護。

將一對雙銀絲電極(電極間距為2 mm)作為刺激電極置于坐骨神經上，陰極靠近中樞端。同心針電極作為記錄電極垂直于肌纖維方向刺入比目魚肌肌腹處。以2倍閾刺激強度的方波電流刺激坐骨神經(SEN-7203，日本NIHON KONDEN公司)，引導比目魚肌M波。

1.5 統計學分析

采用SPSS 10.0統計軟件對實驗數據進行統計學分析。實驗數據以表示，采用單因素方差(ANOVA)分析，顯著性水平α=0.05。

2 結果

2.1 傳入神經傳導速度

本研究用分離單一神經細束的方法在24只大鼠脊髓背根的比目魚肌肌梭傳入神經上共獲得99個單位，按照Hunt(1954)的分類標準[7]，屬于Ⅰ類傳入神經纖維的單位(傳導速度大于72 m/s)共有59個，屬于Ⅱ類傳入神經纖維的單位(傳導速度為24～72 m/s)共有40個。

制動7 d后，大鼠比目魚肌肌梭Ⅰ類傳入神經纖維的傳導速度與正常對照組相比明顯減慢(P<0.01)；Ⅱ類傳入神經纖維與正常對照組相比傳導速度也減慢，但無顯著性差異(P>0.05)。制動14 d后，Ⅱ類神經末梢的傳導速度也降低(P<0.05)。見表1。

表1 制動對比目魚肌肌梭傳入神經傳導速度的影響

2.2 M波潛伏期

制動7 d組M波潛伏期與正常對照組相比無顯著性差異(P>0.05)；制動14 d后，M波潛伏期延長(P<0.05)。見表2。

表2 制動對比目魚肌M波潛伏期的影響

3 討論

本研究利用電生理實驗技術，觀察后肢制動對大鼠比目魚肌神經纖維傳導功能的影響。比目魚肌神經是一種混合神經，它包含比目魚肌的感覺傳入和支配比目魚肌運動的運動神經元的軸突纖維。

M波潛伏期通常作為研究神經肌肉傳遞功能的指標，反映的是運動神經纖維的傳導功能。它由三個部分組成：①從刺激點到有髓神經末梢的傳導時間；②從無髓末梢經運動終板到所支配肌纖維的傳遞時間，即神經-肌肉接頭的傳遞時間；③產生肌纖維動作電位所需的時間，即在肌纖維上的傳播時間。無論哪一部分結構功能的改變均會對M波潛伏期產生影響。Canu等研究表明，神經纖維髓鞘的厚度呈活動依賴性，廢用條件下髓鞘的厚度降低[8]。Alves等最新研究也證實，制動條件下大直徑的神經纖維髓鞘厚度降低[9]。研究資料表明，制動后神經-肌肉接頭的結構發生失神經樣改變，與肌肉興奮-收縮耦聯相關的膜系統結構發生改變，肌纖維膜的電學特性也發生改變[10-12]，這些變化必然會影響神經-肌肉接頭處動作電位的擴布。另外，由于制動后肌肉萎縮，肌纖維的直徑減小，這均會影響到動作電位在軸突末梢和肌纖維的傳導，導致M波潛伏期的延長。本研究結果表明，制動14 d后大鼠比目魚肌M波潛伏期延長。這與Cruz-Martínez等[13]和 Ruegg等[14]的研究結果一致。

本研究結果表明，后肢制動7 dⅠa類感覺末梢的傳導速度降低，明顯早于M波潛伏期的改變。Ⅰa纖維即肌梭的初級感覺末梢，是背根節(DRG)神經元的外周突，進入肌梭后主要感受所在骨骼肌的動態長度變化。神經營養因子-3(neurotrophin-3,NT-3)是本體感覺神經元存活和發揮生理功能所必需的營養因子[15-16]。在成年大鼠的骨骼肌組織中，NT-3主要在肌梭的梭內肌纖維中表達，而且主要是在核袋纖維中表達[17]。本課題組以往研究表明，在脫負荷條件下，肌梭NT-3的表達減少[18]，NT-3的表達減少必然會引起本體感覺神經功能的改變。Hirose等的研究還發現，后肢脫負荷3 d肌梭的Ⅰ型膠原蛋白的表達降低[19]。因此我們推測Ⅰa類傳入纖維傳導功能的改變主要與肌梭的改變有關。

在制動條件下骨骼肌處于脫負荷狀態，肌梭的生理性牽拉刺激減少，因此肌梭的傳入放電活動必然受到影響。我們前期的研究也證實，后肢制動3 d后，肌梭的自發性傳入放電活動即明顯抑制，幾乎所有肌梭在靜息長度下無自發放電，而且感覺末梢動作電位時程隨制動時間的延長而延長(待發表)。動作電位時程的延長必將影響神經纖維上動作電位的傳導。神經纖維傳導速度的降低，反過來將進一步影響肌梭向中樞的信息傳遞。

綜上所述，在制動條件下神經傳導功能降低，而且傳入神經纖維的功能改變要早于且重于運動神經纖維。因此，我們推測，在制動期間增加肌梭的傳入活動能更有效延緩和/或對抗制動條件下神經肌肉功能的改變。

[1]Gondin J,Guette M,Maffiuletti NA,et al.Neural activation of the triceps surae is impaired following 2 weeks of immobilization[J].Eur JAppl Physiol,2004,93(3):359-365.

[2]Lundbye-Jensen J,Nielsen JB.Central nervous adaptations following 1 wk of wrist and hand immobilization[J].J Appl Physiol(1985),2008,105(1):139-151.

[3]Seki K,Kizuka T,Yamada H.Reduction in maximal firing rate of motoneurons after 1-week immobilization of finger muscle in human subjects[J].J Electromyogr Kinesiol,2007,17(2):113-120.

[4]Kühn S,Werner A,Lindenberger U,et al.Acute immobilisation facilitates premotor preparatory activity for the non-restrained hand when facing grasp affordances[J].Neuroimage,2014,92C:69-73.

[5]Booth FW,Kelso JR.Production of rat muscle atrophy by cast fixation[J].JAppl Physiol,1973,34(3):404-406.

[6]趙雪紅,樊小力,宋新艾,等.100 Hz正弦波振動對制動大鼠比目魚肌M波和H反射的影響[J].浙江大學學報醫學版,2011,40(5):545-549.

[7]Hunt CC.Relation of the function to diameter in afferent fibers of muscle nerves[J].JGen Physiol,1954,38(1):117-131.

[8]Canu MH,Carnaud M,Picquet F,et al.Activity-dependent regulation of myelin maintenance in the adult rat[J].Brain Res,2009,1252:45-51.

[9]Alves JS,Leal-Cardoso JH,Santos-Junio FFU,et al.Limb immobilization alters functional electrophysiological parameters of sciatic nerve[J].Braz JMed Biol Res,2013,46(8):715-721.

[10]Fahim MA.Rapid neuromuscular remolding following limb immobilization[J].Anat Rec,1989,224(1):102-109.

[11]Lee S,Yang HS,Sasakawa T,et al.Immobilization with atrophy induces de novo expression of neuronal nicotinicα7 acetylcholine receptors in muscle contributing to neurotransmission[J].Anesthesiology,2014,120(1):76-85.

[12]Kravtsova VV,Shenkman BS,Mikha?lov VM,et al.Effect of functional unloading and dystrophin deficit on the local hyperpolarization of the postsynaptic membrane of a skeletal muscle fiber[J].Biofizika,2010,55(5):834-841.

[13]Cruz-Martínez A,Arpa J.Muscle fiber conduction velocity in situ(MFCV)in denervation,reinnervation and disuse atrophy[J].Acta Neurol Scand,1999,100(5):337-340.

[14]Ruegg DG,Kakebeeke TH,Gabriel JP,et al.Conduction velocity of nerve and muscle fiber action potentials after a space mission or a bed rest[J].Clinical Neurophysiology,2003,114(1):86-93.

[15]Liu J,Chen SS,Dan QQ,et al.Crucial roles of NGF in dorsal horn plasticity in partially deafferentated cats[J].Growth Factors,2011,29(2-3):49-56.

[16]Ramer MS.Endogenous neurotrophins and plasticity following spinal deafferentation[J].Exp Neurol,2012,235(1):70-77.

[17]Copray JC,Brouwer N.Selective expression of neurotrophin-3 messenger RNA in musclespindles of therat[J].Neuroscience,1994,63(4):1125-1135.

[18]任俊嬋,樊小力,宋新艾,等.模擬失重條件下大鼠比目魚肌肌梭神經營養因子3表達降低[J].生理學報,2011,63(1):75-80.

[19]Hirose T,Nakazato K,Song H,et al.TGF-beta1 and TNF-alpha are involved in the transcription of type I collagen alpha2 gene in soleus muscle atrophied by mechanical unloading[J].J Appl Physiol,2008,104(1):170-177.