煙草過氧化氫酶基因CAT1的克隆及表達特征分析

王升平，楊金廣，戰(zhàn)徊旭，申莉莉，錢玉梅，武俠，王鳳龍，李錫宏，陳曉明，宋玉川

1 青島農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)與植物保護學(xué)院 山東省植物病蟲害綜合防控重點實驗室，山東 青島 266109；

2 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所 煙草行業(yè)煙草病蟲害監(jiān)測與綜合治理重點開放實驗室，山東 青島 266101；

3 湖北省煙草科研所，湖北 武漢 430032；

4 貴州省煙草公司遵義市公司，貴州 遵義 563000；

5 云南煙草保山香料煙有限責(zé)任公司，云南 保山 678000

生物技術(shù)

煙草過氧化氫酶基因CAT1的克隆及表達特征分析

王升平1,2，楊金廣2，戰(zhàn)徊旭2，申莉莉2，錢玉梅2，武俠1，王鳳龍2，李錫宏3，陳曉明4，宋玉川5

1 青島農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)與植物保護學(xué)院 山東省植物病蟲害綜合防控重點實驗室，山東 青島 266109；

2 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所 煙草行業(yè)煙草病蟲害監(jiān)測與綜合治理重點開放實驗室，山東 青島 266101；

3 湖北省煙草科研所，湖北 武漢 430032；

4 貴州省煙草公司遵義市公司，貴州 遵義 563000；

5 云南煙草保山香料煙有限責(zé)任公司，云南 保山 678000

基于GeneBank中已有的植物Catalase1（CAT1）基因序列設(shè)計煙草CAT1的特異性引物，通過RT-PCR擴增克隆獲得Nicotiana tabacum var.NC89 CAT1全長mRNA序列，編碼492個氨基酸殘基。遺傳進化分析顯示煙草CAT1與N .benthamiana CAT1基因親緣關(guān)系最近。利用real-time RT-PCR技術(shù)分析了CAT1基因在煙草中的組織表達特異性和煙草NC89應(yīng)對生物和非生物脅迫的表達差異。結(jié)果表明CAT1基因在煙草NC89的根、莖、葉、花瓣、花萼、種子中均有表達，其中在根部表達量最低，在葉中相對表達量最高。生物和非生物脅迫處理煙株，其CAT1誘導(dǎo)表達分析顯示，機械損傷、滲透壓、低溫和高溫、干旱、和感染TMVCAT1表達量上調(diào)，紫外脅迫下表達量下調(diào)。上述研究表明煙草CAT1基因可能參與了植物的生長發(fā)育、應(yīng)對非生物和生物脅迫的過程。

過氧化氫酶；煙草；表達分析；生物脅迫；非生物脅迫

過氧化氫酶（Catalase，CAT）是第一個被發(fā)現(xiàn)的抗氧化酶，Loew將其命名為Catalase[1]，CAT普遍存在于能呼吸的生物體內(nèi)，在植物體內(nèi)主要存在于葉綠體、線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，而在動物體主要存在肝和紅細(xì)胞中[2]。過氧化氫酶主要功能是催化H2O2分解為H2O與O2，減少H2O2與O2在鐵螯合物作用下反應(yīng)生成對植物有害的·OH，研究表明過氧化氫酶在環(huán)境變化產(chǎn)生的活性氧毒害過程中起重要作用[3-4]，其酶促活性為機體提供了抗氧化防御機制。通過提高植物體內(nèi)抗氧化酶活性和增強抗氧化代謝的水平可以提高植物本身的抗逆性[5]。

物理損傷[6]、臭氧[7]、二氧化硫[7]、紫外線[8]和冷害[9]等環(huán)境因素對CATs家族表達影響顯著。研究發(fā)現(xiàn)CAT與植物的抗病反應(yīng)密切相關(guān)，CAT基因缺失的煙草中H2O2含量升高，并產(chǎn)生類似于凋亡的細(xì)胞死亡[10]；在植物受到病原微生物浸染的氧化迸發(fā)初期階段，CAT分解H2O2生成氧分子，觸發(fā)了苯甲酸生成SA，導(dǎo)致系統(tǒng)性防衛(wèi)反應(yīng)（SAR）發(fā)生；轉(zhuǎn)玉米CAT基因的煙草引起更為嚴(yán)重的超敏反應(yīng)（HR），從而有效地控制細(xì)菌感染[11]。現(xiàn)已確定CATs活性的高低與植物對逆境的適應(yīng)呈正相關(guān)，CATs在植物防御、衰老、脅迫應(yīng)答及控制氧化還原平衡等方面具有重要作用[12]。

為揭示煙草CAT1基因在植物應(yīng)對生物脅迫和非生物脅迫中的功能，深入研究植物抗病和抗逆機制。本研究基于已經(jīng)報道的CAT1基因的序列，克隆了煙草NC89（Nicotiana tabacumvar.NC89）CAT1基因并對其進行了表達分析。

1 材料和方法

1.1 材料

煙草材料及毒源：NC89、煙草花葉病毒（Tobacco mosaic virus，TMV）毒源為中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所保存。除特別注明，煙草材料在25℃，14 h光照/10 h黑暗條件下培養(yǎng)。

試劑：LB固體和液體培養(yǎng)基、RNA提取試劑盒，cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒，pEASY-T1載體，大腸桿菌DH5α購自青島群昌科貿(mào)有限公司（TRANS）；dNTP Mixture，Taq酶，Loading buffer，DNA marker、DNA凝膠回收試劑盒等購自寶生物工程（大連）有限公司（TaKaRa）；氨芐青霉素鈉鹽購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；引物：CAT1F：AGAAAGGCAACTAATGGA；CAT1R：ATTGACATCACCTCCTCC由寶生物工程（大連）有限公司（TaKaRa）合成。

1.2 總RNA提取、反轉(zhuǎn)錄

煙草樣品采集后放入液氮中速凍，并轉(zhuǎn)入-80℃超低溫冰箱保存。總RNA提取及反轉(zhuǎn)錄cDNA參照試劑盒說明書，引物為通用引物OligdT18。

1.3 克隆、鑒定及測序

PCR擴增體系總體積為50 μL，包括cDNA 1 μL、引物各 2 μL、10×TransTaqHiFi BufferⅡ 5 μL、2.5 Mm dNTPs 4 μL、TransTaqTMHiFi DNA Polymerase 1 μL、ddH2O 35 μL。擴增條件為：94℃預(yù)變性4 min；94℃變性30 s，50℃退火30 s，72℃延伸1 min，重復(fù)35個循環(huán)；72℃后延伸10 min。擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳回收獲得目的DNA片段，并連接到載體pEASY-T1，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，挑取陽性克隆送上海英濰捷基貿(mào)易有限公司測序。

1.4 樣品器官處理

分別取正常生長條件下成熟煙草NC89的根、莖、葉、花瓣、花萼和種子。

1.5 脅迫處理

1.5.1 機械損傷：對NC89上數(shù)第2片葉進行針刺處理，每片葉針刺50次，分別于刺后的4、8、12、16 h 后取樣，以相同培養(yǎng)條件下的正常生長葉片為對照。

1.5.2 滲透壓：采用250 mmol·L-1NaCl噴施葉面處理2、4、6、8、10 h取上部第2片葉，以清水處理為對照。

1.5.3 溫度處理：在4℃環(huán)境下培養(yǎng)NC89幼苗分別于4、8、12、16 h取上部第2片葉，40℃環(huán)境下培養(yǎng)NC89幼苗分別于4、8、12、16 h取上部第2片葉，以相同溫度的清水澆灌，以25℃培養(yǎng)條件為對照。

1.5.4 干旱處理：消除澆水1、3、5、7 d處理煙苗采集上部第2片葉，以正常澆水為對照。

1.5.5 紫外處理：紫外照射分別于2、4、6、8、10 h采集上部第2片葉片，以正常條件下葉片作對照。

1.5.6 TMV侵染：對NC89接種TMV病毒后，分別24 h、 48 h和72 h后取上部第2片葉，以清水處理為對照。每個處理三次生物重復(fù)，處理后取樣，液氮中研磨成粉末，分裝保存，置于-80℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 real-time RT-PCR對表達差異的分析

提取各處理樣品總RNA并進行反轉(zhuǎn)錄成cDNA，根據(jù)克隆獲得的煙草CAT基因序列，通過PerPrimer軟件進行real-time PCR特異性引物設(shè)計[13]，C1F:TACCGCTCATTCACACCA；C1R:TCACCTCCTCCGAAACCA；18sF：A G G AT T G A C A G A C T G A G A G C；1 8 s R：CACAGACCTGTTATTGCCTC，18s rRNA為內(nèi)參基因。利用Oligo 6.0軟件和在線數(shù)據(jù)庫Oligo Calc（http://www.basic.northwestern.edu/biotools/oligocalc.html）對所設(shè)計的引物進行評價，并通過在線BLSAT程序（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/）進行驗證，PCR反應(yīng)在AB7500 Real-time PCR 儀進行，反應(yīng)體系按TaKaRa SYBR? Premix Ex TaqTM試劑盒說明書。CAT1反應(yīng)程序：95℃ 10 s，95℃ 10 s，95℃ 5 s，54℃ 37 s；18sActin反應(yīng)程序：95℃ 10 s，95℃ 10 s，95℃ 5 s，53℃ 37 s。測定值用平均值加標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用CT值來比較各樣品中CAT1基因的相對表達量，CAT1基因相對表達量用CAT1基因 mRNA水平比18srRNA（內(nèi)參基因）mRNA水平的相對倍數(shù)來表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 CAT1基因克隆及序列分析

根據(jù)Gene Bank中已有的植物CAT1基因序列設(shè)計一對煙草CAT1的特異性引物（CAT1F、CAT1R），通過煙草葉片的總RNA提取，RT-PCR擴增和測序。獲得片段為1532 bp（Genbank登錄號：HF564631），其中包含CAT1 1479 bp完整的讀碼框（ORF）。

圖1 NC89CAT1基因序列擴增Fig.1 PCR amplification of NC89 CAT1 gene sequence

通過DNAMAN 6.0軟件分析CAT1 ORF序列編碼一條492個Aa氨基酸殘基的多肽序列，這與已有報道相符[14]。經(jīng)ExPASy網(wǎng)站ProtParam在線工具分析（http://www.expasy.org/proteomics）預(yù)測分子量為56.85 kDa，等電點（pI）為6.86。利用MEGA 4.0軟件的Neighbor-Joiniing（N-J鄰近法）對已知不同物種的CAT1序列與NC89的CAT1序列進行序列比對構(gòu)建系統(tǒng)進化樹（圖2）。在選取的15個物種中，按CAT1序列劃分為三大類，水稻和小麥各單獨分為一簇； 玉米、大豆、擬南芥和茄科作物分至另一大簇，在這一大簇中又被劃分為5個組，其中擬南芥、玉米與大豆單獨各成一組。普通煙草Petit Havana、N.sylvestris、番茄和馬鈴薯劃分為一個組，在該組中普通煙草Petit Havana和N.sylvestris單獨劃分為一小組，番茄和馬鈴薯被劃分為另一小組。其它煙屬植物劃分至另一個組，該組中三生煙、心葉煙和灰葉煙草劃為一小組，普通煙NC89和本氏煙單獨成另一小組。值得注意的是三生煙、心葉煙和灰葉煙草這一小組中，枯三生和心葉煙均對TMV侵染產(chǎn)生免疫反應(yīng)，灰葉煙草對TMV的反應(yīng)未知，但普通煙草NC89和本氏煙均對TMV表現(xiàn)為系統(tǒng)侵染癥狀。

圖2 植物CAT1系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic trees of plant’s CAT1 gene

2.2 CAT1不同器官表達特異性分析

圖3 煙草NC89不同器官CAT1基因RT-PCR表達量Fig.3 Relative expression levels of CAT1 genes in Nicotiana tabacum organs

煙草NC89不同器官中CAT1基因Real-time RTPCR表達量分析顯示：CAT1基因在煙草NC89的根、莖、葉、花瓣、花萼、種子中都有表達，且器官間CAT1基因表達顯著差異。CAT1基因在根表達量最低，葉中表達量最高，是根的5700倍，花萼次之，是根的1400倍，花瓣和莖中表達量分別是根的270倍、24倍，種子表達量是根的1.5倍（圖3）。

2.3 CAT1脅迫表達分析

機械損傷處理顯示：CAT1基因?qū)C械損傷響應(yīng)較慢。機械損傷4 h后，CAT1基因表達量較對照幾乎未增長，機械損傷8 h和12 h，CAT1基因表達量輕微增加，為對照的3～4倍，處理16 h后CAT1表達量顯著增加達到最大值是對照的43倍。

滲透壓處理也能提高CAT1基因的相對表達量，表達量為先升后降的過程。NaCl處理2 h后出現(xiàn)輕微增加，在處理4 h后達到最高峰是對照的6倍，處理6 h后CAT1基因相對表達量則明顯的下降，處理8 h后CAT1基因的相對表達量與對照基本持平。

低溫處理能夠提高CAT1基因的相對表達量，在處理4 h達到最高值是對照的8倍，處理8 h后開始有輕微的降低是對照的6倍，處理12 h后出現(xiàn)明顯下降是對照的4倍，在處理16 h后達到最低值與對照基本持平。

圖4 非生物誘導(dǎo)處理NC89CAT1基因 RT-PCR表達分析Fig.4 Relative expression of NC89CAT1 gene under abiotic inducement

圖5 接種TMV處理NC89CAT1基因 RT-PCR表達分析Fig.5 Relative expression of NC89CAT1 gene under inoculation of TMV

高溫處理顯示：CAT1基因?qū)?0℃高溫響應(yīng)較快。處理4 h后CAT1基因相對表達量升高是對照的2倍，處理8 h后CAT1基因相對表達量繼續(xù)上升是對照的10倍，處理12 h后CAT1基因相對表達量達到最高值是對照的50倍，處理16 h后CAT1相對表達量則明顯下降，約為對照的10倍。

干旱處理明顯提高了CAT1基因的相對表達量，干旱處理1 d后CAT1基因相對表達量出現(xiàn)輕微增加，在處理3 d后達到最高峰是對照的20倍，處理5 d后CAT1基因相對表達量出現(xiàn)明顯下降與對照相近，處理7 d后表達量與對照持平。

紫外處理明顯抑制了CAT1基因的相對表達量，處理2 h后與對照表達量基本持平，處理4 h后CAT1基因表達量是對照的1/2，處理6 h、8 h后，CAT1表達量是對照的1/20，處理10 h后CAT1基因表達量達到最低水平是對照的1/38。

接種TMV處理CAT1基因先下降后上升，在處理24 h未變化，處理48 h后明顯抑制是對照的1/2，處理72 h后出現(xiàn)上升是對照的2倍。

3 結(jié)論與討論

CATs家族由多基因編碼，在被子植物中，包括煙草、擬南芥、玉米、南瓜和大米等都發(fā)現(xiàn)三種過氧化氫酶基因[15-19]。本研究從N.tabacumvar.NC89葉片克隆獲得CAT1 基因cDNA序列，通過Neighbor-Joiniing（N-J鄰近法）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹分析發(fā)現(xiàn)NC89CAT1與本氏煙的CAT1基因序列同源性較高。

前人研究表明，CAT1的表達具有組織和器官特異性。在正常生長條件下，玉米CAT1在盾片、葉、上胚軸及未成熟果實內(nèi)均有表達[20]；擬南芥CAT1、CAT2和CAT3在花序和種子內(nèi)都表達，CAT2和CAT3在葉中表達量高[21]；蓖麻CAT1主要在胚乳和胚軸中表達[22]。本研究通過real-time RT-PCR對CAT1在NC89的不同組織部位表達特征進行了分析。其結(jié)果：CAT1基因在煙草NC89的根、莖、葉、花瓣、花萼、種子中都有表達，CAT1基因在葉組織中表達量最高，花萼和花瓣次之，根、莖、種子表達量相對較低，其中根組織表達量最低，可能與植物地上部的光呼吸產(chǎn)生的H2O2清除有關(guān)，而相對于地下部的光呼吸產(chǎn)生的H2O2的清除則可能與其他同源基因的表達有關(guān)。

機械損傷脅迫可以使NC89CAT1基因顯著上調(diào)。在玉米未成熟的種子中，機械損傷處理能夠誘導(dǎo)3種CATs基因提高表達量；而在成熟葉片中，僅有CAT1和CAT3表達量提高，都在處理12 h后表達量顯著提高，CAT基因參與了玉米對損傷的適應(yīng)[23]。本研究中，NC89在遭受機械損傷時，CAT1表達量變化與玉米的CAT1基因表達趨勢一致。從而推測NC89在遭受機械損傷時，CAT1表達量與玉米CAT1有同樣的功能。

CAT1的表達與鹽脅迫相關(guān)。高羊茅FaCAT1能夠清除滲透脅迫下產(chǎn)生的H2O2，Northem雜交的時間曲線表明，植株葉片在受到高鹽脅迫時，F(xiàn)aCAT1在高鹽處理4 h后，CAT1的表達量增加到最大[14]。紅麻在鹽漬誘導(dǎo)下CAT酶活性上升，清除活性氧造成的損害[24]。本研究中鹽脅迫能夠提高NC89CAT1表達量，清除高鹽脅迫下產(chǎn)生的H2O2，從而參與高鹽脅迫的適應(yīng)。

低溫和高溫脅迫都能夠引起CAT1基因上調(diào)。在14℃冷鍛煉時玉米CAT3表達增強、酶活力提高，并可以提高在5℃低溫冷處理時對氧化脅迫的抗性[25]；隨著冷馴化時間的延長，擬南芥（Arabidopsis thaliana L.Heynh.）葉綠體基質(zhì)中CAT2的含量都有不同程度地增加[26]，低溫脅迫可使冬小麥葉中CAT活性升高，從而減輕膜脂過氧化傷害，使小麥對低溫產(chǎn)生一定的抗性[27]。Rainwater等發(fā)現(xiàn)，高溫脅迫導(dǎo)致番茄（Solanum lycopersicum Linn.）產(chǎn)量降低，而耐熱品種比熱敏感品種產(chǎn)量降低少，在耐熱品種中CATS活性都明顯增加[28]。本研究中低溫脅迫能誘導(dǎo)NC89CAT1基因上調(diào)，通過提高CAT活性增強煙株對低溫脅迫耐受性。而在高溫脅迫條件下CAT1基因表達量提高說明CAT1基因可能在夏季高溫天氣適應(yīng)過程中發(fā)揮著重要作用。

干旱脅迫能夠誘導(dǎo)CAT1基因上調(diào)。高粱具有較強的抗早能力和傷害修復(fù)及超補償能力，在干旱脅迫條件下高粱CAT活性顯著增加[29]。玉米在干旱脅迫下CAT等保護酶活性先升高后降低[30]。受到嚴(yán)重干旱時，小麥CAT1和CAT2的表達量顯著增強[31]。本研究表明在煙株遭受干旱脅迫時，CAT1基因上調(diào)，可以推測其在適應(yīng)干旱條件有著重要作用。

紫外脅迫能夠引起CAT1基因下調(diào)。55 mJ·m-2強度的紫外線照射影響N.plumbaginifolia L.三種CAT基因表達量，CAT1基因下調(diào)，而CAT2和CAT3基因上調(diào)[8]。胡蘿卜CAT1基因在紫外處理1 h后被誘導(dǎo)表達,而CAT2、CAT3則在處理6 h后才被誘導(dǎo)表達[32]。本研究結(jié)果與在N.plumbaginifolia L.中CAT1基因變化一致，而與胡蘿卜等植物中的CAT1基因表達量變化相反，因此推測在紫外光脅迫下可能引起NC89葉片光合作用的光失活，而CAT1基因表達受到光抑制，而此時NC89體內(nèi)H2O2的清除可能由其他同源基因發(fā)揮作用。

植物受病原物侵染后，其過氧化物酶活性均有提高，而寄主植物的抗病性強弱不同其增幅也有差異。Sean等試驗表明，病毒侵染后CAT酶活性降低[33]；陳學(xué)平等研究表明，抗病品種CAT酶活性在感染TMV后低于感病品種[34]；馬學(xué)萍等發(fā)現(xiàn)枯斑三生煙接種病毒后響應(yīng)TMV侵染傷害CAT酶活性提高，隨后酶活降低可能與病毒侵染誘導(dǎo)植株獲得系統(tǒng)抗性，緩解了病毒對植株的生理脅迫[35]。Zhanlin等的研究結(jié)果表明，感病植株接種病毒后前5天CAT酶活性升高，以后隨之降低；而在保護植株中（以前曾接種過病毒，目前檢測不到病毒含量，但是已獲得對病毒免疫能力的植株）并沒有發(fā)現(xiàn)CAT酶活性的明顯變化[36]。到目前為止，煙株感病后體內(nèi)CAT活性變化及其機制還未得到一致的結(jié)論，一般認(rèn)為抗病品種的增減率低于感病品種，可能是由于抗病品種能盡快地接受病毒侵染信號并迅速傳遞、及時啟動防衛(wèi)反應(yīng)的結(jié)果。本研究煙草NC89CAT1基因由于接種TMV出現(xiàn)上調(diào)，推測CAT1基因在抗TMV方面具有一定作用。

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Cloning of catalase gene（CAT1） and its expression patterns inNicotiana tabacumL.

WANG Shengping1,2，YANG Jinguang2，ZHAN Huaixu2,SHEN Lili2，QIAN Yumei2，WU Xia1，WANG Fenglong2,LI Xihong3,
CHEN Xiaoming4,SONG Yuchuan5

1 Key Lab of Integrated Crop Pest Management of Shandong Province,College of Agronomy and Plant Protection,Qingdao Agricultural University,Qingdao 266109,Shandong,China；
2 Key Laboratory of Tobacco Pest Monitoring Controlling & Integrated Management,Tobacco Research Institute,Chinese Academy of Agricultural Sciences,Qingdao 266101,Shandong,China；
3 Tobacco Research Institute of Hubei Province,Wuhan 430030,China；
4 Zunyi Municipal Tobacco Company,Zunyi 563000,Guizhou,China；
5 Baoshan Oriental Tobacco Company,Baoshan 678000,Yunnan,China

The full-length cDNA of Catalase 1(CAT1)from Nicotiana tabacum var.NC89 was cloned based on specific primers designed according toCAT1mRNA sequences in other plants.An amino acid sequence alignment indicated thatCAT1contains 492 amino acid residues.Phylogenetic analysis showed that NC89CAT1shares high similarity with gene from N.benthamiana.Real-time quantitative polymerase chain reaction(qPCR)analysis revealed thatCAT1is highly expressed in leaf and calyx,while less expressed in roots and seeds.The expression of NC89CAT1was enhanced by abiotic and biotic stressors,such as mechanical damage,osmotic pressure,low temperature,high temperature,drought,and TMV infection,whereas it was inhibited by ultraviolet irradiation.It was suggested thatCAT1plays an important role in growth,development,and interplay of abiotic and biotic stresses in plant.

catalase；nicotiana tabacum；expression analysis；biotic stress；abiotic stress

10.3969/j.issn.1004-5708.2014.05.017

Q81 文獻標(biāo)志碼：A 文章編號：1004-5708（2014）05-0103-07

國家煙草專賣局全國煙草有害生物調(diào)查研究(110200902065)；湖北省煙草公司科技項目（027Y2013-006）；云南省煙草公司科技項目（2013YN37）；遵義市煙草公司科技項目（2013-11）；山東省“泰山學(xué)者”建設(shè)工程專項經(jīng)費；中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院基本科研業(yè)務(wù)費預(yù)算增量項目（2013ZL025）

王升平（1988—），農(nóng)學(xué)碩士，植物病理學(xué)，Email:844862497@qq.com

武 俠（1963—），博士，教授，植物線蟲學(xué)，Tel：0532-86080594；Email:wuxia3897@163.com王鳳龍（1964—），博士，研究員，植物病毒學(xué)，Email:wangfl@sohu.com

2013-10-21