氮用量對烤煙成熟期葉片碳氮代謝及萜類代謝相關基因表達的影響

王紅麗,楊惠娟,蘇菲,3,李海江,張要旭,楊軍杰,史宏志

1 河南農業大學 煙草學院，河南 鄭州 450002；

2河南省煙草公司平頂山市公司，河南 平頂山 467002；

3 云南省煙草公司,昆明市公司東川分公司，云南 昆明 654199

氮用量對烤煙成熟期葉片碳氮代謝及萜類代謝相關基因表達的影響

王紅麗1,楊惠娟1,蘇菲1,3,李海江2,張要旭2,楊軍杰1,史宏志1

1 河南農業大學 煙草學院，河南 鄭州 450002；

2河南省煙草公司平頂山市公司，河南 平頂山 467002；

3 云南省煙草公司,昆明市公司東川分公司，云南 昆明 654199

為探索氮用量對烤煙碳氮代謝的影響，在前期不同氮素營養水平上在成熟期統一調虧，分析烤煙葉片糖代謝、氮代謝、淀粉代謝及萜類代謝相關關鍵基因的表達水平。結果顯示：糖代謝中3個關鍵基因，胞外蔗糖轉化酶(Inv)和蔗糖合成酶(SuS)基因隨著煙葉的成熟表達量升高，在不同氮水平處理間表達水平差異無統計學意義。蔗糖磷酸合成酶(SPS )基因表達量在煙葉成熟前期隨之前施氮量的降低而降低。淀粉代謝中顆粒結合型淀粉合成酶( GBSSI )基因表達量既不受煙葉成熟時期的影響也不受前期供氮水平的影響。氮代謝中硝酸還原酶（NR）基因在不同成熟時期及不同的供氮處理間表達量均無差異。谷氨酰胺合成酶（GS） 基因的表達量在煙葉成熟后期呈降低趨勢，且受前期供氮水平的影響較大。萜類代謝途徑中3-羥-3甲基戊二酰輔酶A還原酶（HMGR）基因表達量隨著煙葉的成熟先升高再降低，在成熟后期表達量隨前期供氮水平的降低而降低。表明在前期供氮水平不一致的基礎上于成熟期統一調虧，對成熟后期煙葉氮素的同化吸收過程和萜類代謝影響較大。煙葉糖代謝和淀粉代謝受煙葉成熟時期的影響最大。

烤煙；氮素；碳氮代謝；基因表達

氮素對植物生命活動有極其重要的作用。氮素是蛋白質、核酸、磷脂等的主要組成成分，氮在植物體內的主要存在形態是蛋白質[1-2]。在煙葉各種代謝過程中，碳氮代謝是最基本和最重要的代謝，其代謝強度和協調程度對煙葉的生長發育和決定煙葉產量品質各類化學成分的形成轉化有重要影響，直接或間接關系到煙葉產量和品質的形成和提高[3]。拓陽陽[4]研究表明硝酸還原酶和轉化酶活性都存在顯著性差異，隨著煙葉的生長成熟，葉綠素、硝酸還原酶和轉化酶活性均呈下降趨勢，不同烤煙品種不同生長階段的碳氮代謝強度具有顯著性差異。許晨曦[5]研究表明隨氮素水平的提高同一品種煙草的硝酸還原酶、蔗糖轉化酶、淀粉酶活性均提高；但在成熟期，增加施氮量后，煙草的淀粉酶活性反而降低。云菲[6]等研究結果表明隨著光強的降低轉化酶(INV)活性逐漸降低，但充足的氮素營養能夠促進碳代謝。隨光強減弱和施氮量增加，煙堿、總氮含量上升，碳水化合物含量下降，總體上呈現氮代謝強于碳代謝的趨勢。史宏志[7]研究發現，在葉片功能盛期以前，隨著施氮量的增加，淀粉酶活性增高，碳的固定和轉化增強，但碳積累代謝減弱；煙葉成熟階段，淀粉酶活性高時，碳的分解代謝旺盛，其活性與施氮量呈負相關。隨著施氮水平的增高，煙葉各期的轉化酶活性均升高，表明增施氮肥可以促進碳代謝的增強。岳俊芹[8]對不同氮素形態影響的研究發現，純施硝態氮有利于還原糖的積累；純施銨態氮的煙葉中谷酰胺合成酶和蔗糖合成酶活性在成熟期一直保持在相對較高的水平上，煙堿含量最高；硝態氮與銨態氮各占50%的情況下，煙葉碳氮代謝協調。

目前，關于氮素營養對煙葉生長發育和品質影響的研究多集中在大田條件下控制氮素用量和氮素形態比例等方面[9-11]，但大田條件下很難實現氮素營養的動態精準調控。氮素供應不足將導致煙葉刺激性降低，勁頭不足；氮素過多，則煙株氮代謝旺盛，煙葉難以正常生理成熟。合理的施氮量可以保證煙株正常的生長發育，達到體內碳氮代謝平衡，有利于優良品質的形成。鑒于此，本文采用盆栽試驗，在育苗基質固持的條件下進行全營養液培養，使煙株前期生長在不同氮素營養條件下，后期則進行氮素調虧，減少其氮素供應，研究了不同生長時期氮素精準動態供應對烤煙碳氮代謝關鍵基因表達水平的影響，以期為烤煙的動態精準施肥提供依據。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

本研究在河南省郟縣采用盆栽試驗套盆設計，供試品種為烤煙NC297。盆栽試驗中種植盆缽高30 cm，直徑35 cm，底盆直徑40 cm，所用填充固持材料為烤煙育苗基質。煙株生長營養全部由Hoagland營養液提供，營養液組成為NH4NO3、KH2PO4、K2SO4、MnSO4、H3BO3、CuSO4、ZnSO4、EDTAFe、MgSO4、Ca(NO3)2·4H2O、H2MoO4、H2O。采 用分析純試劑配制Hoagland營養液，營養液中各種元素 N、P、K、Mg、Zn、Cu、Mn、B、Mo、Fe的 質量濃度分別為140、40、300、40、0.05、0.02、0.50、0.50、0.05、5.60 mg/L。

1.2 試驗設計

研究設計了前期不同氮素營養協同成熟期氮素調虧試驗，共設4個處理，每個處理栽種8盆。烤煙于2012年5月10號移栽，團棵前每5 d添加1次營養液，之后每3 d添加1次營養液。移栽后28 d進入團棵期，移栽后56 d打頂，打頂后進行同量氮素調虧，即把氮素質量濃度降至35 mg/L，Hoagland營養液中其余元素濃度保持不變。團棵前N1、N2、N3、N4處理每次分別添加營養液的體積為：2.250 L、1.875 L、1.500 L、1.125 L，其中N2處理為根據大田推薦施氮量確定的正常施氮量,添加后均按差量用清水補足到2.5 L；團棵后N1、N2、N3、N4處理每次分別添加營養液的體積為：2.725 L、2.213 L、1.700 L、1.188 L，添加后均按差量用清水補足到3.0 L。打頂后各處理每次分別添加營養液的體積均為1 L，按差量用清水補足到2 L。

1.3 碳氮代謝基因和萜類代謝基因的RT-PCR檢測

分別在移栽后60 d，70 d和80 d選取生長發育良好的不同煙株的 3 片上二棚葉，于液氮中冷凍保存。采用Trizol 法提取煙草總RNA[12]，通過隨機引物法反轉錄合成cDNA。檢測內參基因L25[13]及目的基因lnv、SuS、SPS、GBSS、NR1、GS和HMGR表達量用的引物如表1.PCR體系：cDNA1 μL ，diH2O 為11 μL，上游引物和下游引物均為1.5 μL，含染料的Taqmix 為15 μL，整個PCR體系共30 μL。反應程序：94℃預變性5 min；94℃變性30 s；退火溫度依各引物Tm值變化而變化(47℃～60℃)；72℃延伸1 min；35 個循環；72℃延伸10 min，于4℃保存。

表1 擴增引物序列Tab.1 Amplification primer sequence

1.4 數據處理分析

采用LaunchVisionWorksLS軟件對RT-PCR檢測所得半定量圖片進行量化，提取各個基因表達的亮度相對值進行對比，每個基因均以移栽后60天N2處理為基準。

2 結果與分析

2.1 氮素營養協同成熟期同量調虧處理對糖代謝關鍵基因表達的影響

胞外蔗糖轉化酶(extracellular invertase,Inv)，在高等植物蔗糖代謝中起著關鍵的作用，參與植物的生長、器官建成、糖分運輸、韌皮部卸載及調節庫組織糖分構成及水平，其酶活性常作為衡量碳代謝強度的重要指標；如圖1表2所示，Inv基因的表達強度隨生育期的推進而逐漸增強，移栽后60天表達量均較低，在處理間表現為N1＜N2＜N3＜N4。而在移栽后70天、80天表達量明顯增加，70天時處理間沒有明顯差異，80天時表現為基因表達量隨前期施氮量的增加而增加。蔗糖合成酶( sucrose synthase,SuS)主要是將運輸入葉片中的蔗糖降解,提供合成淀粉等多糖的葡萄糖供體,承擔著非光合組織中為其它合成反應提供核苷酸糖類的任務。SuS基因在不同的生育期表達量不同，隨生育期的推進表達量有逐漸增加的趨勢，但不如Inv基因表達量增加明顯。蔗糖磷酸合成酶( sucrosephosphate synthase,SPS )，是催化蔗糖生成的關鍵酶，也是控制碳素分配和流向的關鍵酶[14]。SPS基因在移栽后60天表達強度弱于其余兩個時期，SPS基因表達量在移栽后60天時四個處理間有差異，N3處理亮度相對值為59.3明顯低于其余各處理，在70天與80天時表達量在發育時期與處理間均無明顯差異（圖1，表2）。

圖1 不同發育時期烤煙 Inv,SuS和SPS基因的檢測結果Fig.1 Results of Inv,SuS,SPS genes on different growing stages

表2 氮素營養協同成熟期同量調虧處理對糖代謝關鍵基因表達的影響Tab.2 Effects of regulated deficit of nitrogen nutrition during mature stage on expression of key genes in carbohydrate metabolism

2.2 氮素營養協同成熟期同量調虧處理對淀粉代謝關鍵基因表達的影響

顆粒結合型淀粉合成酶( GBSSI )，是控制直鏈淀粉合成的關鍵酶。如圖2表3所示，GBSSI基因在不同發育時期表達量變化不大，同一時期不同處理間差異不明顯，在移栽后70天N4處理表達量相對值為126.9稍高于其余各處理，移栽后80天N4處理表達量相對值為84.0低于其余各處理(圖2，表3)。

圖2 不同發育時期烤煙GBSSI基金的檢測結果Fig.2 Results of GBSSI gene on different growing stages

表3 氮素營養協同成熟期同量調虧處理對GBSSI基因表達的影響Tab.3 Effects of regulated deficit of nitrogen nutrition during mature stage on expression of GBSSI gene

2.3 氮素營養協同成熟期同量調虧處理對氮代謝關鍵基因表達的影響

硝酸還原酶（NR），是氮代謝的第一個關鍵酶和限速酶，主要作用是把NO3-離子還原成NO2-離子。如圖3表4所示，NR的基因表達量隨生育期的推進先升高再降低，在同一時期不同處理間無明顯差異。谷氨酰胺合成酶（glutamine synetase，GS,又稱為N素轉移酶）催化產生谷氨酰胺，GS常與谷氨酸合酶（glutamate synmase，GOGAT）協同作用，組成GS/GOGAT循環，這是高等植物NH4+同化的主要途徑。GS基因的表達量在移栽后70天高于其余兩個時期，在移栽后60天和70天時各處理間表達量沒有明顯差異，在80天時N3、N4處理的亮度相對值分別為70.1,54.1明顯低于N1,N2處理（圖3，表4）。

圖3 不同發育時期烤煙NR和GS基因的檢測結果Fig.3 Results of NR and GS genes on different growing stages

表4 氮素營養協同成熟期同量調虧處理對氮代謝關鍵基因表達的影響Tab.4 Effects of regulated deficit of nitrogen nutrition during mature stage on expression of key genes in nitrogen metabolism

2.4 氮素營養協同成熟期同量調虧處理對萜類代謝關鍵基因表達的影響

3-羥-3甲基戊二酰輔酶A還原酶( HMGR)，是植物甲羥戊酸途徑調控的第一個限速酶，也是細胞質萜類代謝中的重要調控位點。如圖4表5所示，HMGR基因的表達量在移栽后70天時各處理的基因表達量均高于移栽后60天時的表達量，隨之在移栽后80天時表達量又逐漸降低。四個處理間的表達量有明顯差異，在移栽后60天N3,N4處理HMGR基因表達量亮度相對值分別為204.5,183.0明顯高于N1,N2處理，移栽后70天N1處理亮度相對值為387.9明顯低于其余各處理，移栽后80天表現為隨前期施氮量的增加基因表達強度增強(圖4，表5)。

圖4 不同發育時期烤煙HMGR基金檢測結果Fig.4 Results of HMGR gene on different growing stages

表5 氮素營養協同成熟期同量調虧處理對HMGR基因表達的影響Tab.5 Effects of regulated deficit of nitrogen nutrition during mature stage on expression of HMGR gene

3 討論

在煙葉生長和成熟過程中其碳氮代謝的動態變化對煙葉品質都會產生重大影響[3]。本研究表明，糖代謝中3個關鍵基因，胞外蔗糖轉化酶和蔗糖合成酶基因表達均受煙葉成熟時期的影響較大，煙葉越趨向成熟其基因表達量越高，而不受前期氮素施用量影響，在各個時期的4個處理間2個基因的表達量均無差異。但SuS基因的表達量整體低于Inv基因。SPS基因的表達量在煙葉成熟前期隨打頂前施氮量的降低而降低，隨著煙葉成熟期的退后表達量在4個處理間趨于一致。糖代謝3個關鍵基因表達量的變化說明打頂后隨著煙葉的成熟糖代謝關鍵基因表達量均趨向升高，表明糖代謝活動也越來越活躍，糖代謝過程受煙葉成熟時期影響較大而受前期氮素施用量影響較小。

淀粉代謝中顆粒結合型淀粉合成酶( GBSSI )基因表達既不受煙葉成熟時期的影響也不受前期供氮水平的影響，表明前期供氮對淀粉合成代謝影響不大。

氮代謝中硝酸還原酶（NR）基因在不同成熟時期和不同的前期供氮處理間表達量均無差異。N素轉移酶GS基因 的表達強度在成熟前期無差異，越到煙葉成熟后期表達量越低且隨前期供氮水平的降低表達量也降低。結果說明氮代謝途徑中煙葉固氮能力隨著煙葉的成熟而降低，且前期供氮水平越低氮素吸收能力也將越低。

萜類代謝MVA途徑中3-羥-3甲基戊二酰輔酶A還原酶HMGR是控制萜類代謝的限速酶，其表達量隨著煙葉的成熟先升高再降低，在成熟前期表達量在四個處理間均較低，在成熟中期表達量都升高，而在成熟后期表達量隨即又降低，但在這一時期表達量受前期供氮水平的影響，前期供氮越高，其表達量也越高。結果表明萜類代謝在煙葉成熟中期最活躍，前期供氮水平對煙葉成熟后的萜類代謝影響最大。

綜上所述，在前期供氮水平不一致的基礎上成熟期統一調虧，對煙葉糖代謝和淀粉代謝影響不大，而對成熟后期煙葉氮素的同化吸收過程和萜類代謝影響較大。

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Effects of nitrogen on expression of key genes related to carbon/nitrogen metabolism and terpenoid metabolism in matruing flue-cured tobacco leaves

WANG Hongli1,YANG Huijuan1,SU Fei1,3,LI Haijiang2,ZHANG Yaoxu2,YANG Junjie1,SHI Hongzhi1

1 College of Tobacco,Henan Agricultural University,Zhengzhou 450002,China;
2 Henan Pingdingshan Tobacco Company,Pingdingshan 467002,Henan,China;
3 Kunming Dongchuan Tobacco Company,Yunnan Provincial Tobacco Company,Kunming 654199,China

Expression of key genes involved in sugar,nitrogen,starch and terpenoid metabolism pathways were tested by regulated deficit nitrogen nutrition to study effects of different nitrogen applications on carbon and nitrogen metabolism in flue-cured tobacco.Results indicated that in sugar metabolism pathway Inv and SuS genes’ expression increased when tobacco leaf became more mature while not affected by early nitrogen level.Expression of SPS gene decreased with decline of nitrogen supply at early maturing stage.GBSSI gene in starch metabolism pathway was not affected by either maturity or early nitrogen supply.GS gene expressed at lower level in maturing stage and affected by early nitrogen supply while NR gene expression was not affected.HMGR gene expression in terpenoid metabolism pathway decreased when leaf became more mature and decreased with decline of early nitrogen supply.The assimilation of nitrogen and terpenoid metabolism were significantly affected when regulated deficit of nitrogen was applied at early growing stage.Sugar and starch metabolism were affected mostly at leaf maturing stage.

flue-cured tobacco; nitrogen; carbon and nitrogen metabolism; gene expression

10.3969/j.issn.1004-5708.2014.05.019

S572.6; Q81 文獻標志碼：A 文章編號：1004-5708（2014）05-0116-05

河南省煙草公司科技項目（HYKJ2012M06）

王紅麗（1989—），在讀碩士，主要從事煙草栽培生理研究,Email：379714360@qq.com

史宏志（1963—），博士，教授，博士生導師，主要從事煙草栽培生理研,Email:shihongzhi88@163.com

2013-10-14