阿托伐他汀通過轉錄因子AP1抑制AS大鼠VSMC增殖及促凋亡

李玉媚，王 輝*，康 敏，張文宇，陳 偉，胡 楠，歐和生*

(廣西醫科大學 1.藥學院; 2.第一附屬醫院 耳鼻喉科，廣西 南寧 530021)

研究論文

阿托伐他汀通過轉錄因子AP1抑制AS大鼠VSMC增殖及促凋亡

李玉媚1，王 輝1*，康 敏2，張文宇1，陳 偉1，胡 楠1，歐和生1*

(廣西醫科大學 1.藥學院; 2.第一附屬醫院 耳鼻喉科，廣西 南寧 530021)

目的探討阿托伐他汀對動脈粥樣硬化(AS)大鼠主動脈平滑肌細胞(VSMC)調節及轉錄因子AP1的作用。方法80只大鼠隨機分為: 普通飼料組、AS組和阿托伐他汀高低劑量組(40和10 mg/kg·d)。用原位TUNEL檢測細胞凋亡；用免疫組化檢測血管中AP1和α-SM-actin蛋白表達；用蛋白免疫印跡法檢測血管相關蛋白AP1表達。結果阿托伐他汀高和低劑量組TG、TC和LDL明顯下降(Plt; 0.05)。阿托伐他汀抑制AS大鼠VSMC增殖，促進其促凋亡(Plt;0.05)。阿托伐他汀干預后AS大鼠VSMC中AP1和α-SM-actin蛋白表達明顯減少(Plt;0.05)。結論阿托伐他汀通過下調AP1抑制AS大鼠VSMC增殖及促凋亡。

阿托伐他汀; 血管平滑肌細胞；AP1；α-SM-actin

血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cell, VSMC)表型改變及調控是AS最重要和關鍵因素。VSMC的正常增殖與分化是維持血管正常功能的必要條件。他汀類藥物通過改善血管內皮細胞功能、抑制炎性反應、抑制VSMC增生和凋亡、減少脂質在血管內皮層的沉積及泡沫細胞形成、抑制血小板的活性和聚集等, 從而達到穩定斑塊的作用[1- 2]。AP1與VSMC表型轉變及VSMC增殖、凋亡、分化和遷移的發生發展密切相關[3]。本研究探討阿托伐他汀對AS大鼠VSMC增殖和凋亡的影響及AP1的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

AP1單克隆抗體和α-SM-actin抗體(Santa Cruz 公司)；SABC(鼠 IgG)POD試劑盒(廣州銳博生物科技有限公司)；DAB顯色試劑盒(北京百泰克生物技術有限公司)；ECL(Invitrogen公司)；辣根過氧化物酶結合抗體(南寧博仁生物科技有限公司)。

1.2 實驗動物

SPF級SD大鼠(體質量250～300 g) 80只，雌雄各半，由廣西醫科大學動物實驗中心提供，動物許可證號：[SCXK(桂)2010- 0003]。隨機均分為：普通飼料組、動脈硬化組和阿托伐他汀高低劑量組。

靜脈取血，用全自動生化儀測定血脂，以各組生化指標顯著升高為造模成功標志。在前10周,阿托伐他汀組喂養同AS組，后5周分別每日加溫水灌服阿托伐他汀(10 mg/kg)、(40 mg/kg)[4]。

1.3 方法

1.3.1 血脂測定：各組動物分別在第15周結束后，經中央動脈采血，將2 mL動脈血靜置后，以酶比色測定法檢測血清總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)和低密度脂蛋白膽固醇(LDL)。

1.3.2 組織形態學的檢查：分離胸主動脈，用10%甲醛溶液固定、石蠟包埋、3～4 μm厚度切片。常規脫蠟和脫水后HE染色，觀察AS病變情況。

1.3.3 TUNEL檢測細胞凋亡：石蠟切片脫蠟及水化后，經封閉、透化后加入TUNEL 反應液，于37 ℃孵育60 min，用DAB 法顯色。

1.3.4 免疫組化方法檢測AP1和α-SM-actin蛋白表達：石蠟切片脫蠟和水化， PBS洗3次，0.01 mol/L檸檬酸鹽液熱修復抗原90 s。接著PBS洗3次，室溫孵育15 min。PBS洗3次，非免疫血清封閉40 min，室溫下孵育10 min。除去血清，滴加Ⅰ抗AP1(1∶400)或α-SM-actin(1∶500)，37 ℃下孵育1 h。再滴加二抗體IgG(1∶300)，置于室溫20 min，PBS洗3次。滴加DAB顯色。滴加蘇木精復染2 min，鹽酸分化，PBS洗10 min。最后脫水、封片。顯微鏡下觀察，隨機選取10個視野，計算吸光度值，取平均值。

1.3.5 Western blot檢測蛋白質表達：提取VSMC總蛋白，取50 μg蛋白質在8%SDS-PAGE上電泳，后電轉至PVDF膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，將膜加入AP1(工作濃度1∶1 000)并在4 ℃孵育過夜。TBST緩沖液洗膜3次，每次10 min．二抗(辣根過氧化物酶結合的抗體(工作濃度1∶1 000)雜交，37 ℃孵育45 min，TBST緩沖液洗膜3次，每次10 min。將膜與化學發光檢測試劑反應2 min：A、B混合溶液激發熒光,在暗室X線曝光，顯影、定影后進行圖像分析。

1.4 統計學分析

2 結果

2.1 阿托伐他汀對AS大鼠血脂的影響

與正常組比較，AS組TG、TC與LDL明顯升高(Plt;0.05)；與AS組比較，阿托伐他汀高及低劑量組TG、TC與LDL顯著下降 (Plt;0.05)。

2.2 阿托伐他汀對AS大鼠主動脈形態的影響

普通飼料組大鼠主動脈內膜光滑完整，未見增生。平滑肌層與中層彈力膜相間排列且整齊，內皮與內彈性膜緊貼，內膜不剝脫(圖1A)。AS組大鼠主動脈內膜損傷、增生，中層VSMC大量增生并向內膜遷移且紊亂，中膜彈性纖維斷裂，粥樣斑塊向外凸出并破裂 (圖1B)。阿托伐他汀高劑量組內膜損傷明顯減輕，內膜增生顯著減少，血管壁變薄(圖1C)。阿托伐他汀低劑量組內膜損傷減輕，內膜增生減少，血管壁變薄(圖1D)。

2.3 阿托伐他汀對AS大鼠VSMC凋亡的影響

與對照組比較，AS組VSMC呈棕褐色，包括核膜皺縮及胞核的崩解，表達增多(Plt;0.01)；與AS組比較，阿托伐他汀高及低劑量細胞凋亡率明顯增加(Plt;0.01)。高劑量組凋亡率比低劑量組增加更顯著(Plt;0.05) (表1，圖2)。

2.4阿托伐他汀對動脈硬化大鼠VSMC特異性α-SM-actin蛋白的影響

4組大鼠胸主動脈的中膜均呈陽性染色、AS組和阿托伐他汀高、低劑量組的增生內膜及中膜呈高表達。與對照組對比,α-SM-actin在AS組表達顯著增加(Plt;0.01)；與AS對比，α-SM-actin在阿托伐他汀高及低劑量組表達明顯下降(Plt;0.01)(表1，圖3)。

A.control group；B.AS group；C.high-dose atorvastatin group；D.low-dose atorvastatin group圖1 大鼠胸主動脈組織形態學改變Fig 1 Thoracic aortic morphological changes in rats(HE×200)

A.control group；B.AS group；C.high-dose atorvastatin group；D.low-dose atorvastatin group圖2 阿托伐他汀對平滑肌細胞凋亡影響Fig 2 Effect of the atorvastatin on apoptosis of VSMC(×200)

A.control group；B.AS group；C.high-dose atorvastatin group；D.low-dose atorvastatin group圖3 阿托伐他汀對α-SM-actin蛋白表達影響Fig 3 Effect of the atorvastatin on α-SM-actin protein expression(×400)

groupapoptosisindexAvaluerate(%)control 8.5±1.575.74±5.32—AS25.3±2.1*45.35±4.25*67.01high-doseatorvastatin33.5±2.4*#64.42±5.62*#42.05low-doseatorvastatin30.2±2.4*#58.34±5.43*#28.6

*Plt;0.01 compared with control；#Plt;0.05 compared with AS.

2.5 阿托伐他汀對AS VSMC AP1蛋白影響

免疫組化檢測AP1蛋白表達，AP1陽性染色呈棕黃色。與對照組對比, AP1在AS組表達顯著增加(Plt;0.05)；與AS對比，AP1在阿托伐他汀高及低劑量組表達明顯下降(Plt;0.01)(表2，圖4)。

2.6 阿托伐他汀抑制AP1蛋白表達

與對照組對比, AP1蛋白表達在AS組表達顯著增加(Plt;0.05)；與AS對比，AP1蛋白表達在阿托伐他汀高及低劑量組表達明顯下降(Plt;0.01)(表2，圖5)。

A.control group；B.AS group；C.high-dose atorvastatin group；D.low-dose atorvastatin group圖4 阿托伐他汀對AP1蛋白表達的影響Fig 4 Effect of the atorvastatin on AP1 protein expression(×400)

groupAvaluerate(%)Avaluerate(%)control 52.67±4.52— 1.32±0.06—AS 40.52±3.41*-23.07 1.70±0.03*-28.78high-doseatorvastatin 65.52±6.35**#61.70 0.45±0.02**#73.53low-doseatorvastatin 61.32±7.43**#51.33 1.02±0.05**#40.00

*Plt;0.05，**Plt;0.01 compared with control；#Plt;0.05 compared with AS.

1.control group；2.AS group；3.high-dose atorvastatin group；4.low-dose atorvastatin group圖5 阿托伐他汀對AP1蛋白表達影響Fig 5 Effect of atorvastatin on AP1 protein expression

3 討論

阿托伐他汀在AS發生發展過程中發揮重要作用[5]。本文探討阿托伐他汀對AS大鼠VSMC增殖和凋亡的影響及AP1的作用。研究發現，阿托伐他汀通過下調AP1抑制AS大鼠VSMC增殖及凋亡。

VSMC和內皮細胞增殖和凋亡是AS病變主要原因，而VSMC增殖和凋亡起主導作用[6]。阿托伐他汀具抗氧化、調節細胞鈣穩態及細胞凋亡等作用[7]。本研究發現，阿托伐他汀高及低劑量組α-SM-actin蛋白表達下降且凋亡率提高。提示阿托伐他汀促進AS大鼠VSMC凋亡，起到延緩AS發生和發展的作用。

AP1參與細胞生長調控，AP1蛋白表達水平與VSMC增殖密切相關[8]。此外，AP1與Ras有絲分裂信號共同參與VSMC生長[9]。一些轉錄因子在細胞增殖、凋亡過程中扮演重要角色，細胞增殖能力降低與一些轉錄因子：AP1, SP1,HSF-1,E2F表達水平下降有關[10]。此外，AP1(c-fos和c-jun)是G1期進程關鍵控制點[11]。因此，選AP1檢測，結果發現，阿托伐他汀通過下調AP1抑制AS大鼠VSMC增殖及凋亡。另外，不同劑量他汀類藥物通過調脂和非調脂協同作用，可有效預防AS及血管成形術后再狹窄。高劑量組阿托伐他汀對AS大鼠VSMC抑制更加明顯。該作用機制可能是阿托伐他汀通過調節AP1表達水平而影響VSMC增殖及凋亡。但AP1參與VSMC增殖的分子作用機制尚不清楚。

綜上所述，本研究闡明阿托伐他汀與某些轉錄因子調控細胞的分子機制，AP1可能介導阿托伐他汀在VSMC增殖或凋亡中起調控作用。本研究為研究心血管疾病靶點提供一種新方法，其潛在臨床應用也具有重要現實意義。

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Atorvastatin inhibits the proliferation andptomotes apoptosis of VSMC by the transcription factor AP1 in rats

LI Yu-mei1, WANG Hui1*, KANG Min2, ZHANG Wen-yu1, CHEN Wei1, HU Nan1, OU He-sheng1*

(1.College of Pharmacy,Guangxi Medical University;2.Dept. of Ear-nose-throat, the First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University,Nanning 530021,China)

ObjectiveTo investigate effect of atorvastatin to inhitit proliferation and to promote apoptosis of VSMC by the transcription factor AP1 in rats.MethodsEighty rats were randomly divided into four groups: normal group,AS group, high-dose atorvastatin group (40 mg/kg·d), low-dose atorvastatin group (10 mg/kg·d).The VSMC apoptosis was detected by TUNEL assay.The protein expression level of AP1 and α-SM-actin were measured by immunohistochemical analysis and Western blot.ResultsTG, TC and LDL were significantly decreased in two atorvastatin groups (Plt;0.05). Atorvastatin significantly inhibited the VSMC proliferation and induced apoptosis (Plt;0.05). Atorvastatin regulated AP1 and α-SM-actin protein expression significantly decreased(Plt;0.05).ConclusionsThe atorvastatin suppresses proliferation and promotes apoptosis of VSMC through down-regulation of AP1 expression in rats suppressing AP1 expression in VSMC.

atorvastatin; vascular smooth muscle cell;AP1；α-SM-actin

2014- 03- 20

2014- 05- 27

國家自然科學基金(81373403); 廣西碩士研究生科研創新項目(YCSZ2013031)

*通信作者(correspondingauthor)：hsouol@yahoo.com; 465580297@qq.com

1001-6325(2014)10-1339-05

R 97

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