多巴胺受體2減輕離體大鼠心肌缺血/再灌注損傷

李鴻珠，高 君，郝曉敏，張麗敏，陳俊亭

(1.哈爾濱醫科大學 基礎醫學院 病理生理學系專業， 黑龍江 哈爾濱 150086； 2.哈爾濱市第一醫院 骨三科，黑龍江 哈爾濱 150010； 3.哈爾濱醫科大學 基礎醫學院 機能實驗中心， 黑龍江 哈爾濱 150086；4.哈爾濱醫科大學 附屬第四醫學院 麻醉科， 黑龍江 哈爾濱 150001)

研究論文

多巴胺受體2減輕離體大鼠心肌缺血/再灌注損傷

李鴻珠1*，高 君2，郝曉敏3，張麗敏3，陳俊亭4

(1.哈爾濱醫科大學 基礎醫學院 病理生理學系專業， 黑龍江 哈爾濱 150086； 2.哈爾濱市第一醫院 骨三科，黑龍江 哈爾濱 150010； 3.哈爾濱醫科大學 基礎醫學院 機能實驗中心， 黑龍江 哈爾濱 150086；4.哈爾濱醫科大學 附屬第四醫學院 麻醉科， 黑龍江 哈爾濱 150001)

目的觀察多巴胺受體2(DR2)對離體大鼠心肌缺血/再灌注(I/R)損傷的影響及其可能機制。方法將大鼠40只，每組n=10，隨機分成對照組(control)、I/R組、10 μmol/L Bromocriptine(DR2激動劑)組(Bro)，10 μmol/L Haloperidol (DR2抑制劑)組(Hal)。用Langendorff離體灌流裝置，復制大鼠心肌I/R損傷模型。Powerlab生理記錄儀記錄心功能；比色法測定冠脈流出液LDH、CK活性和心肌組織勻漿SOD活性以及MDA含量；TUNEL染色檢測心肌細胞凋亡；Western blot檢測DR2、Bcl- 2、caspase- 3和caspase- 9蛋白的表達。結果與對照組比較，I/R組DR2、Bcl- 2、caspase- 3和caspase- 9蛋白表達、LDH和CK活性、MDA含量和細胞凋亡率均增加(Plt;0.01)，唯有SOD活性降低，心功能減弱(Plt;0.01)。與I/R組比較，Bro降低LDH和CK活性、MDA含量、細胞凋亡率、caspase- 3和caspase- 9的表達，升高SOD活性，改善心功能和進一步增加Bcl- 2的表達(Plt;0.01)；Hal對上述指標影響不顯著。結論DR2可減輕心肌I/R損傷，其機制與抗氧化、清除自由基、上調Bcl- 2表達以及下調caspase- 3和caspase- 9的表達有關。

多巴胺受體2；缺血/再灌注損傷；細胞凋亡；大鼠；心肌

缺血性心臟病的死亡率占所有器官之首。揭示心肌缺血/再灌注損傷的發生機制和研發有效的保護藥物，已成為國內外的關注熱點。

多巴胺受體屬于G蛋白偶聯受體，有5種亞型：D1、D2、D3、D4 和D5，根據其藥理作用和結構特征將其分為D1和D2兩個家族，D1和D5受體屬于D1受體家族，D2、D3和D4受體屬于D2受體家族[1]。一直以來對多巴胺受體的研究，主要集中在帕杰森病、精神分裂癥、藥物成癮等神經精神系統疾病上[2- 3]。已有報道，從腦組織克隆出的所有DR在外周均存在[2- 3]。本實驗前期研究發現，在大鼠心肌缺血/再灌注損傷過程中，DR2表達增加[3]，并且其激活通過抑制線粒體、死亡受體途徑及MAPK通路減輕乳鼠心肌細胞缺血/再灌注損傷[4- 5]。但是，DR2激活對離體大鼠心肌缺血/再灌注損傷的影響及機制尚未見報道。本研究觀察DR2激活對心肌缺血/再灌注損傷的影響及其可能機制。

1 材料與方法

1.1 動物

清潔級Wistar大鼠，體質量0.25～0.3 kg，雌雄不拘，由哈爾濱醫科大學實驗動物學部提供(合格證號：SCXK(黑)2013- 001)。

1.2 主要試劑

Bromocriptine(Bro)和Haloperidol(Hal)(Sigma-Aldrich公司)，Western 及IP細胞裂解液(碧云天生物技術研究所)，DR2、Bcl- 2、caspase- 3和caspase- 9抗體(Santa Cruz Biotechnology 公司)，超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、乳酸脫氫酶(LDH)和肌酸激酶(CK)檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所有限公司)，TUNEL 凋亡檢測試劑盒(Roche試劑公司)。

1.3 方法

1.3.1 模型制備：大鼠腹腔注射2%戊巴比妥鈉(2 mg/kg)及肝素(1 000 IU/kg體質量)。麻醉后迅速取出心臟，通過主動脈逆行插管連接在Langendorff離體灌流裝置上，以80 mmH2O的壓力Krebs-Henseleit磷酸緩沖液灌流大鼠心臟，灌流過程中用95% O2和5% CO2混合氣體平衡灌流液。

1.3.2 實驗分組：40只大鼠，隨機分為4組，每組n=10。1)對照組：心臟正常灌流180 min；2)I/R組：心臟先預灌注平衡20 min，停止灌流40 min之后再復灌120 min；3)Bro組：方法同I/R組，只是在復灌時加入10 μmol/L Bro；4)Hal組：方法同I/R組，只是在復灌時加入10 μmol/L Hal。

1.3.3 生化指標檢測：心肌再灌注后，留取冠脈流出液，測定LDH和CK的活性。將心肌用組織勻漿器研磨并制成10%組織勻漿，按照試劑盒說明書檢測 SOD 活性和 MDA 含量。

1.3.4 TUNEL染色檢測細胞凋亡：取心室肌切成0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm的小塊，然后固定、脫水、浸蠟、包埋，制成厚度為10 μm的切片，光鏡下觀察細胞凋亡情況。正常心肌細胞核染成藍色，凋亡的細胞核呈棕褐色，數不少于500個心肌細胞核，凋亡率計算：AI(%)=(凋亡細胞數/500)×100%

1.3.5 心功能測定：用Powerlab生理記錄系統記錄各項心功能指標：左室末端舒張壓(left ventricular end diastolic pressure, LVEDP)，左室發展壓(left ventricular developed pressure, LVDP)以及左室內壓最大上升(下降)速率(positive and negative maximum rate of left ventricular pressure development,±dp/dtmax)。

1.3.6 Western blot檢測DR2、Bcl- 2、caspase- 3和caspase- 9蛋白表達：取心肌組織加入蛋白裂解液，冰浴40 min，4 ℃，12 000 r/min離心15 min，取上清液進行蛋白質定量。取50 μg蛋白樣品于10% SDS-PAGE凝膠電泳；隨后轉印于PVDF濾膜上，用5% 脫脂奶粉，37 ℃封閉1 h；用封閉液稀釋一抗，4 ℃振蕩過夜；TBST稀釋二抗，室溫振蕩孵育2 h；最后顯色，計算條帶吸光度值，蛋白表達水平以其與GAPDH吸光度比值來表示。

1.4 統計學分析

2 結果

2.1 DR2蛋白表達變化

與對照組比較，I/R組DR2蛋白表達明顯增加(Plt;0.01)(圖1)。

*Plt;0.01 compared with control group圖1 DR2蛋白表達Fig 1 DR2 protein expressions

2.2 LDH、CK、SOD活性和MDA含量的變化

與對照組比較，I/R明顯增加LDH、CK活性和MDA含量，而降低SOD活性(Plt;0.01)；與I/R組比較，Bro顯著降低LDH、CK活性及MDA含量，升高SOD活性(Plt;0.01)(表1)。

表1 LDH、CK和SOD活性及MDA含量變化

*Plt;0.01 compared with control group;#Plt;0.01 compared with I/R group.

2.3 各組心功能變化

與對照組比較，I/R組心功能明顯減弱(Plt;0.01)；與I/R組比較，Bro顯著改善心功能(Plt;0.01)(表2)。

2.4 心肌細胞凋亡率的變化

與對照組比較，I/R組細胞凋亡率明顯增加(Plt;0.01)；與I/R組比較，Bro組細胞凋亡率明顯減少(Plt;0.01)(圖2)。

表2 心功能各個指標的改變Table 2 The changes of cardiac fuction(±s, n=10)

*Plt;0.01 compared with control group;#Plt;0.01 compared with I/R group.

*Plt;0.01 compared with control group; #Plt;0.01 compared with I/R group圖2 心肌細胞凋亡率的變化Fig 2 The changes of the apoptosis rate ofcardiomyocytes(×400)

2.5 Caspase- 3、caspase- 9和Bcl- 2蛋白表達變化

與對照組相比，I/R增加caspase- 3、caspase- 9和Bcl- 2蛋白表達 (Plt;0.01)；與I/R組比較，Bro降低caspase- 3和caspase- 9的表達，增加Bcl- 2的表達 (Plt;0.01)(圖3)。

3 討論

目前認為，心肌I/R損傷的機制與心肌能量代謝障礙、氧自由基大量產生、細胞內鈣離子超載、血管內皮細胞分泌一系列內皮因子等因素有關[6]。

*Plt;0.01 compared with control group; #Plt;0.01 compared with I/R group圖3 Caspase- 3、caspase- 9和Bcl- 2蛋白表達變化Fig 3 The changes of caspase- 3, caspase- 9 and Bcl- 2 protein expressions

氧自由基的大量產生，可使心肌組織脂質過氧化物增多，MDA含量增加，進而導致細胞膜結構改變，使心肌細胞受損[3]。dp/dtmax、LVSP、LVEDP 等指標，可反映心肌功能的情況[7]。本研究顯示，I/R增加DR2蛋白表達，且I/R組LDH和CK漏出及MDA含量均增加，SOD活性降低，心功能減弱；而Bro則減少LDH和CK漏出及MDA含量，升高SOD活性，改善心功能。說明DR2激活可減輕心肌I/R損傷，其機制與清除自由基和減少脂質過氧化有關。

心肌I/R損傷可導致細胞凋亡。線粒體在細胞凋亡中發揮著重要的作用。I/R可引起線粒體通透性轉換孔(mPTP)開放導致線粒體內釋放細胞色素C(Cyt c)、Smac/DIABLO和AIF等線粒體凋亡因子，引起細胞凋亡[4]。Cyt c釋放到細胞質后，可激活caspase- 9，后者進一步激活 caspase- 3 導致細胞凋亡。Bcl- 2 通過抑制Cyt c的釋放和 caspase 激活發揮抗凋亡作用[4]。

本結果顯示，I/R組細胞凋亡率、caspase-3、caspase-9和Bcl- 2 蛋白表達均增加，而Bro降低細胞凋亡率，抑制 caspase- 3 和 caspase- 9 的表達，促進 Bcl- 2 的表達。說明DR2 激活可通過下調 caspase- 3 和 caspase- 9 的表達，上調 Bcl- 2 的表達發揮抗細胞凋亡作用。I/R時Bcl- 2表達增加，可能是機體的一種代償性適應性反應。

綜上所述，DR2激活可減輕I/R對心肌細胞的損傷，其機制與抗氧化、上調Bcl-2表達及下調caspase- 3/- 9的表達有關。激活心肌DR2有望為缺血性心臟病的防治提供一個新思路和新靶點。

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[2] 魏璨，高君，陳愛東，等.多巴胺受體(DR2)激活對乳鼠心肌細胞缺氧再灌注損傷的保護作用及其機制[J].中國應用生理學雜志，2013, 29: 289- 293.

[3] 李鴻珠，徐長慶，韓麗萍，等. 大鼠心肌多巴胺受體在缺氧-復氧時表達變化及其意義[J]. 中國病理生理雜志，2007, 23: 2322- 2326.

[4] Li HZ, Guo J, Gao J,etal. Role of dopamine D2 receptors in ischemia/reperfusion induced apoptosis of cultured neonatal rat cardiomyocytes[J]. J Biomed Sci, 2011, 18:18.

[5] 高君，魏璨，陳愛東，等. 2 類多巴胺受體激活對細胞凋亡的影響及與 MAPK 通路的關系[J]. 中華臨床醫師雜志，2013, 7:4878- 4882.

[6] 吳青，周祖玉，陶大昌.葛根素預處理對大鼠缺血再灌注心肌細胞凋亡的影響[J].基礎醫學與臨床，2005,25:147- 151.

[7] 馬立權，王紅霞，油紅捷，等.缺血后處置緩解離體大鼠心肌缺血/再灌注損傷[J].基礎醫學與臨床，2007,27:259- 262.

DR2 attenuates myocardial ischemia/reperfusion injury of rats in vitro

LI Hong-zhu1*, GAO Jun2, HAO Xiao-min3, ZHANG Li-min3, CHEN Jun-ting4

(1.Dept. of Pathophysiology, Harbin Medical University, Harbin 150086; 2.the First Hospital of Harbin, Harbin 150010; 3.Experiment Center, Harbin Medical University, Harbin 150086; 4.Dept. of Anesthesiology, the Fourth Affiliated Hospital ofHarbin Medical University, Harbin 150001, China)

ObjectiveTo observe the effects of dopamine receptors-2 (DR2) on the myocardial ischemia/reperfusion (I/R) injury in rats and to study the possible mechanisms.Methods40 Wistar rats were randomly divided into 4 groups (n=10): control group, I/R group, Bromocriptine group (Bro) and Haloperidol group (Hal). Myocardial ischemia/reperfusion injury of isolated rats was induced by Langendorff system; The heart function was recored by Powerlab; LDH, CK activities of coronary effluent and SOD activity and MDA content of myocardial tissue homogenate were measured by colorimetric method; Myocardial cell apoptosis was detected by TUNEL staining; The expression of DR2, Bcl- 2, caspase- 3 and caspase- 9 was detected by Western blot.ResultsCompared with control group, the expressions of DR2, Bcl- 2, caspase- 3, caspase- 9, the activity of LDH and CK, the MDA content, the rate of cell apoptosis were increased (Plt;0.01), but the SOD activity and heart function were decreased in the I/R group (Plt;0.01). Compared with I/R group, Bro decreased the activity of LDH and CK, the MDA content,

the rate of cell apoptosis, the expression of caspase- 3 and caspase- 9, increased the SOD activity and Bcl- 2 expressions, improved heart function (Plt;0.01). Hal did not change the above indexes.ConclusionsDR2 inhibites I/R injury through antioxidation that is poteintially explained by scavenging free radical, up-regulation of Bcl- 2 expressions and down-regulation of caspase- 3 and caspase- 9 expression.

dopamin receptors- 2; ischemia/reperfusion injury; apoptosis; rats; myocardium

2014- 03- 17

2014- 05- 27

黑龍江省教育廳科學技術研究項目(12531348)

*通信作者(correspondingauthor)：hongzhuli61@163.com

1001-6325(2014)10-1372-04

R 542.2

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