hsa-mir-615過表達胰腺癌穩定細胞亞系的構建及功能初步驗證

孫 洋，張婷婷，王翠萍，陳 杰*，趙 紅

(中國醫學科學院 北京協和醫學院 1.國家心血管病中心 阜外心血管病醫院 心血管疾病國家重點實驗室 病理科;2.北京協和醫院 病理科；3.北京積水潭醫院 病理科, 北京 100730)

hsa-mir-615過表達胰腺癌穩定細胞亞系的構建及功能初步驗證

孫 洋1,2，張婷婷2,3，王翠萍2，陳 杰2*，趙 紅1

(中國醫學科學院 北京協和醫學院 1.國家心血管病中心 阜外心血管病醫院 心血管疾病國家重點實驗室 病理科;2.北京協和醫院 病理科；3.北京積水潭醫院 病理科, 北京 100730)

慢病毒(Lentivirus)載體可以將外源基因有效地整合到宿主染色體上，從而達到持久性表達[1]。本實驗在對胰腺癌差異表達的microRNA進行研究時發現hsa-mir-615在胰腺癌組織和胰腺正常導管上皮組織中呈現差異表達[2]，異常表達的microRNA可能具有生物學功能。因此，本實驗構建hsa-mir-615過表達慢病毒載體并包裝成慢病毒，感染人胰腺癌細胞MIA PaCa-2，建立hsa-mir-615過表達穩定細胞系，使用CCK-8法觀察hsa-mir-615對胰腺癌細胞系生長的影響，為進一步研究hsa-mir-615的生物功能構建細胞模型。

1材料與方法

1.1 細胞系及包裝病毒：胰腺癌細胞系MIA PaCa-2(American type culture collection，ATCC)。慢病毒包裝細胞系為人類胚腎上皮細胞系293T細胞(中國醫學科學院北京協和醫院分子病理實驗室保存)。慢病毒包裝采用羅氏LV系統(Tronolab公司)，由pRsv-REV、pMDlg-pRRE、pMD2G、Lenti-GFP-RNAi四質粒系統組成。

1.2 主要試劑及引物：RNA提取、反轉錄合成cDNA、qPCR及hsa-mir-615表達檢測試劑盒(曠博公司)(Cat.0960602， Cat. 0960401，Cat. 0960211及Cat.0960302)。內切酶及連接酶(NEB公司產品)。轉染使用羅氏FuGENE? HD轉染試劑。

根據genbank及mirbase數據庫[3]獲取基因hsa-mir-615(Gene ID: 693200)序列，設計擴增引物：mir-615-F:5′-CTGT GTGCGCCCAAATTTACGACG-3′，mir-615-R:5′-CGGAATTC AGGGGTGAATAGCTTGCAGCGTTCC-3′

1.3 hsa-mir-615過表達慢病毒制備：采用PCR技術，以含有has-mir-615基因前體的人基因組DNA為模板擴增目的基因，連接入Lenti-GFP-RNAi載體后，轉化入DH5α培養。PCR及測序鑒定細菌陽性克隆，擴增轉化菌后提取含有mir-615DNA的Lenti-GFP-RNAi質粒, 按照說明書在293T細胞中制備慢病毒。

1.4 miR-615過表達穩轉系建立及驗證：將靶細胞分為未處理組(MIA PaCa-2)、mock組(MIA PaCa-2-pLTUGW-Mock)和mir-615組(MIA PaCa-2-pLTUGW-615)，分別感染PBS、空載病毒及含有mir-615DNA的病毒。感染48 h后，觀察靶細胞熒光表達，流式細胞術檢測感染效率，RT-qPCR法檢測miR-615表達情況。

1.5 CCK-8法檢測細胞活率：將未處理的MIA PaCa-2，Miapaca-2-pLTUGW-615和Miapaca-2-pLTUGW-Mock細胞均以3 000個細胞/孔接種于96孔板，于接種后24、48、72、96和120 h時更換為含10% CCK-8的培養基，37 ℃、 5% CO2的條件下培養1.5 h，檢測波長為A450時的吸光度值。

2結果

2.1 hsa-mir-615過表達胰腺癌穩定細胞系的構建:hsa-mir-615DNA擴增(圖1)、酶切、重組載體PCR鑒定，PCR產物帶與預期目的分子大小一致。病毒感染MIA PaCa-2細胞48 h后，流式測定感染效率接近或超過90%。與對照細胞相比， MIA PaCa 2-pLUGW-mir-615 中mir-615過表達(圖2)。由于慢病毒能夠整合到細胞的基因組中，從而可以穩定地表達目的基因，據此構建穩定細胞系。

2.2 mir-615功能初步驗證:用CCK-8法檢測miR-615對胰腺癌細胞的生長情況的影響，相對于mock組， mir-615組從72 h開始即能夠顯著抑制MIA PaCa-2(圖3)細胞的生長；與mock組相比， 72、 96、120 h抑制率分別為23.79%、 26.55%和38.67%(均Plt;0.05)。

1～3.hsa-mir-615; M.marker圖1 hsa-mir-615擴增 Fig 1 Amplification of hsa-mir-615

*Plt;0.05 compared with MIA PaCa 2-pLUGW-miR-615圖2 RT-qPCR鑒定mir-615過表達Fig 2 RNA expression of miR-615was assessedby RT-qPCR

3討論

hsa-mir-615位于人類染色體12q13.13，存在于胚胎發育過程中重要轉錄因子HOX基因組群集區內。作為一個新發現的microRNA分子，關于miR-615的研究還比較少，本研究已經證實在胰腺癌組織中存在miR-615的成熟體miR-615-5p的低表達，并且使用瞬時轉染的方法在體外研究發現miR-615的兩個成熟體miR-615-5p和miR-615-3p對胰腺癌細胞均具有生長抑制作用。由于瞬時轉染人工合成的 miRNA mimics在細胞內很容易被降解，不能實現穩定的miRNA 表達。為了能夠長期穩定觀察miR-615的功能，本實驗使用慢病毒系統構建穩定過表達miR-615的胰腺癌細胞系。為下一步的功能實驗提供穩定過表達miR-615的模型。

*Plt;0.05,**Plt;0.01 compared with MIA Pala2-pLUGW-mir-615圖3 未處理的Miapaca-2細胞Miapaca-2-pLTUGW-615細胞和Miapaca-2-pLTUGW-Mock細胞的生長曲線Fig 3 Cell survival analysis of MIA PaCa-2 cellsoverexpressing miR-615

為了研究miR-615基因的功能，使用CCK-8實驗初步檢驗了miR-615組和mock組細胞的增殖情況，在相同數目鋪板的情況下，本研究建立的miR-615穩定過表達的胰腺癌細胞的生長速度比mock組慢，自72 h起即具有統計學意義,這個結果與瞬時轉染miR-615 mimic時對胰腺癌細胞的生長功能相一致。

本研究首次構建miR-615過表達的穩定細胞系，為miR-615用于胰腺癌的基因治療邁出重要一步，為后續實驗和臨床治療奠定了基礎。

[1] Rubinson DA, Dillon CP, Kwiatkowski AV,etal. A lentivirus-based system to functionally silence genes in primary mammalian cells, stem cells and transgenic mice by RNA interference[J]. Nat Gene, 2003, 33: 401- 406.

[2] Backes C, Meese E, Lenhof HP,etal. A dictionary on microRNAs and their putative target pathways[J]. Nucleic Acids Res, 2010, 38: 4476- 4486.

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2013- 12- 12

2014- 03- 25

國家自然科學基金 (30973470, 81172334)；國家科技支撐計劃(十一五)項目 (2006BAI02A14)；衛生部衛生行業科研專項項目(200802011)

*通信作者(correspondingauthor)：xhblk@163.com

1001-6325(2014)10-1414-02

R 735.9

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