慢病毒介導(dǎo)E2F-1基因過表達抑制人胃癌MGC-803細(xì)胞增殖的分子機制

曹穩(wěn)瓏，韋尉元，羅 文，張笑石，嚴(yán)林海，謝玉波，肖 強*

(廣西醫(yī)科大學(xué) 第一附屬醫(yī)院 1.胃腸腺體外科；2.麻醉科， 廣西 南寧 530021)

慢病毒介導(dǎo)E2F-1基因過表達抑制人胃癌MGC-803細(xì)胞增殖的分子機制

曹穩(wěn)瓏1，韋尉元1，羅 文1，張笑石1，嚴(yán)林海1，謝玉波2，肖 強1*

(廣西醫(yī)科大學(xué) 第一附屬醫(yī)院 1.胃腸腺體外科；2.麻醉科， 廣西 南寧 530021)

目的探索E2F-1基因過表達抑制人胃癌MGC-803細(xì)胞增殖的分子機制。方法用攜帶E2F-1基因的重組慢病毒顆粒(LV-E2F-1-GFP)感染人胃癌MGC-803細(xì)胞，作為實驗組(LV-E2F-1-GFP組)；以對照慢病毒顆粒(LV-GFP)感染人胃癌MGC-803細(xì)胞，作為陰性對照組(LV-GFP組)；空白對照組常規(guī)培養(yǎng)，不做任何處理。用RT-PCR和Western blot技術(shù)檢測細(xì)胞中Skp2、Bax、Bcl-2和survivin基因的表達。結(jié)果與LV-GFP組和空白對照組比較，LV-E2F-1-GFP組人胃癌MGC-803細(xì)胞Skp2、Bcl-2和survivin基因的mRNA和蛋白的表達降低(Plt;0.05)，Bax基因的mRNA和蛋白的表達上調(diào)(Plt;0.05)。結(jié)論慢病毒介導(dǎo)E2F-1基因過表達可能通過降低Skp2、survivin、Bcl-2基因表達和上調(diào)Bax基因表達來抑制人胃癌MGC-803細(xì)胞增殖。

胃癌；MGC-803細(xì)胞；E2F-1; 過表達

在我國，胃癌的發(fā)病率及病死率均位居所有惡性腫瘤首位，每年因胃癌死亡人數(shù)約占全球胃癌病死總?cè)藬?shù)的1/4[1]。惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程涉及多基因多因素的相互作用，其中細(xì)胞凋亡的信號傳導(dǎo)通路失調(diào)與腫瘤的侵襲、生長的關(guān)系最為密切。E2F-1作為細(xì)胞轉(zhuǎn)錄的重要調(diào)節(jié)因子和眾多基因轉(zhuǎn)錄的啟動子, 前期的體內(nèi)外實驗證實E2F-1對腫瘤的生長具有抑制作用[2-3]，但機制尚不十分明確。因此本實驗通過重組慢病毒顆粒介導(dǎo)E2F-1基因過表達轉(zhuǎn)染人胃癌MGC-803細(xì)胞，觀察對凋亡相關(guān)基因Skp2、Bax、Bcl-2和survivin表達的影響，初步探討E2F-1過表達抑制人胃癌MGC-803細(xì)胞增殖的分子機制。

1 材料與方法

1.1 材料

含E2F-1基因過表達的重組慢病毒顆粒(Genechem公司)。兔抗人一抗HA抗體(Santa Cruz公司)，羊抗兔二抗IgG抗體(Pierce公司)。人胃癌MGC-803(中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫)。Trizol試劑(Invitrogen公司)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒(中國上海生工生物公司)。細(xì)胞培養(yǎng)基RPMI1640及胎牛血清(Gibco公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與基因轉(zhuǎn)染：人胃癌MGC-803細(xì)胞用含10%(體積分?jǐn)?shù))胎牛血清DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)，在37 ℃、5%(體積分?jǐn)?shù)) 的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。隔天細(xì)胞換液。取對數(shù)生長期細(xì)胞接種于6孔板中，3.5×104個/孔，用不含抗生素的10% DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)，觀察待細(xì)胞匯合度達40%～60%時，按慢病毒轉(zhuǎn)染說明書操作，以E2F-1基因過表達重組慢病毒顆粒(LV-E2F-1-GFP)和對照慢病毒顆粒(LV-GFP)分別感染人胃癌MGC-803細(xì)胞，作為實驗組(LV-E2F-1-GFP組)和陰性對照組(LV-GFP組)，空白對照組細(xì)胞不做任何處理，常規(guī)培養(yǎng)。待細(xì)胞長滿孔板，常規(guī)消化收集細(xì)胞樣本，進入下一步實驗。

1.2.2 RT-PCR檢測人胃癌MGC-803細(xì)胞E2F-1、Skp2、Bax、Bcl-2和survivin基因mRNA的表達：用Trizol法提取各組細(xì)胞的總RNA，按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明反轉(zhuǎn)錄獲取cDNA， PCR 儀擴增。E2F-1 上游引物：5′-CCCAACTCCCTCTACCCT-3′,下游引物：5′-CTCCCATCTCATATCCATCCTG-3′，長度217 bp, 退火溫度54 ℃；Skp2上游引物：5′-GCTGCTAAAGGT CTCTGGTGT-3′,下游引物：5′-AGGCTTAGATTCTGC AACTTG-3′，長度291 bp,退火溫度60 ℃；Bax上游引物：5′-CCAAGAAGCTGAGCGAGTGT-3′,下游引物：5′-CCGGAGGAAGTCCAATGTC-3′;長度269 bp,退火溫度55 ℃；Bcl-2上游引物：5′-GACTTCGCCGA GATGTCCAG-3′,下游引物：5′-CATCCCAGCCTCCGT TATCC-3′，長度259 bp,退火溫度62 ℃；survivin上游引物： 5′-AAATGCACTCCAGCCTCTGT-3′，下游引物：5′-TGTCGAGGAAGCTTTCAGGT-3′，長度為311 bp，退火溫度60 ℃；內(nèi)參GAPDH上游引物：5′-ACCACA GTCCATGCCATCAC-3′，下游引物：5′-TCACCACCCT GTTGCTGTA-3′，長度為450 bp，退火溫度52 ℃。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性4 min；30個循環(huán)，94 ℃ 30 s,52～62 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s；72 ℃延伸5 min。取3 μL PCR產(chǎn)物經(jīng)2%非變性瓊脂糖凝膠電泳檢測，凝膠成像獲取圖片經(jīng)Quantity One 軟件分析，對Skp2、Bax、Bcl-2和survivin基因與其內(nèi)參吸光度值的比值進行半定量比較，然后在組間相互比較。

1.2.3 Western blot檢測人胃癌MGC-803細(xì)胞E2F-1、Skp2、Bax、Bcl-2和survivin蛋白的表達：使用組織裂解液提取各組細(xì)胞總蛋白，用BCA法測定蛋白含量。取100～125 μg蛋白在10% SDS-PAGE膠上電泳，后轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride，PVDF膜)，用TBST配制5%脫脂奶分別加入兔抗人Skp2、Bax、Bcl-2和survivin抗體(1∶1 000)，于常溫孵育1.5 h；加入羊抗兔抗體IgG(1∶12 000)，常溫孵育30 min，膠片曝光顯影，以GAPDH為內(nèi)參照。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1E2F-1基因過表達對人胃癌MGC-803細(xì)胞E2F-1、Skp2、Bax、Bcl-2和survivin基因mRNA表達量的影響

LV-E2F-1-GFP組Skp2、Bcl-2和survivin的mRNA表達量低于LV-GFP組及空白對照組(Plt;0.05)，E2F-1和Bax的mRNA 的表達量高于LV-GFP組及空白對照組(Plt;0.05)(圖1，2；表1)。

2.2E2F-1基因過表達對人胃癌MGC-803細(xì)胞E2F-1、Skp2、Bax、Bcl-2和survivin的蛋白表達量的影響

LV-E2F-1-GFP組Skp2、Bcl-2和survivin的蛋白表達量低于LV-GFP組及空白對照組(Plt;0.05)，E2F-1和Bax的蛋白的表達量高于LV-GFP組及空白對照組(Plt;0.05)(圖3，表2)。

M.500 bp marker; 1.LV-E2F-1-GFP group; 2.LV-GFP group; 3.control group圖1 RT-PCR檢測E2F-1、Bax和Bcl-2的mRNA表達Fig 1 RT-PCR detection of E2F-1, Bax and Bcl-2 mRNA expression

表1 各組細(xì)胞中凋亡相關(guān)基因mRNA的表達情況Table 1 The mRNA expression level of apoptosis-related genes in each group(±s, n=18)

*Plt;0.05 compared with LV-GFP group and blank control group.

表2 各組細(xì)胞中凋亡相關(guān)基因的蛋白表達情況Table 2 The protein expression level of apoptosis-related genes in each group(±s, n=18)

*Plt;0.05 compared with LV-GFP group and blank control group.

M.500 bp marker; 1.LV-E2F-1-GFP group; 2.LV-GFP group ; 3.control group圖2 RT-PCR檢測Skp2和survivin的mRNA表達Fig 2 RT-PCR detection of the expression of Skp2 and survivin mRNA

1.LV-E2F-1-GFP group; 2.LV-GFP group;3.control group圖3 Western blot檢測E2F-1、Bax、Bcl-2、Skp2和survivin蛋白的表達Fig 3 Western blot detection of E2F-1, Bax, Bcl-2, Skp2 and survivin protein expression

3 討論

轉(zhuǎn)錄因子E2F-1是細(xì)胞G1期進入S期最重要的轉(zhuǎn)錄因子之一,調(diào)控著下游基因的表達。Skp2參與調(diào)控細(xì)胞增殖和凋亡，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)[4]。Bcl-2家族分為促凋亡亞家族和抗凋亡亞家族，而Bcl-2和Bax分別為這兩個亞家族的經(jīng)典代表[5-6]。Survivin是一種凋亡抑制蛋白，其具有抑制細(xì)胞凋亡和促進細(xì)胞異常增殖的作用[7]。前期研究表明，E2F-1基因過表達可以抑制胃癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲力，促進胃癌細(xì)胞凋亡[2]；前期的體內(nèi)動物實驗也發(fā)現(xiàn)：含有轉(zhuǎn)錄因子E2F-1基因過表達的重組反轉(zhuǎn)錄病毒載體瘤內(nèi)注射可抑制人胃癌裸鼠移植瘤的生長[3]，但機制尚不明確。因此，探索E2F-1過表達對凋亡相關(guān)基因Skp2、Bax、Bcl-2和survivin表達的影響，研究其可能的作用機制具有重要意義。

本研究表明LV-E2F-1-GFP組Skp2、Bcl-2和survivin的mRNA和蛋白的表達量顯著降低，而Bax顯著升高。有研究表明，Skp2表達下降，從而解除了Skp2對P27的抑制[8]，而P27基因高表達通過EGFR/PI3K/Akt信號通路可使細(xì)胞DNA合成受抑制，從而抑制腫瘤細(xì)胞的分裂和增殖[9]。Bcl-2編碼的蛋白主要作用是保持線粒體膜的完整性, 抑制細(xì)胞色素C的釋放, 從而促進細(xì)胞生存，抑制細(xì)胞凋亡[10]，而Bax蛋白可拮抗Bcl-2的保護效應(yīng)從而使細(xì)胞趨于凋亡[11]。Survivin的表達水平下調(diào)使caspase-3、caspase-9和Bax在mRNA和蛋白水平上表達增加[12-13]，從而間接解除了survivin過表達對caspase-9、caspase-3、bax基因表達的抑制作用，啟動了凋亡的信號通路，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。本研究表明，E2F-1基因過表達可使人胃癌MGC-803細(xì)胞中凋亡相關(guān)基因Skp2、Bcl-2和survivin的mRNA及蛋白表達水平均顯著下調(diào)，基因Bax的mRNA及蛋白表達水平均上調(diào)，與前期研究E2F-1過表達可抑制胃癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力,促進了胃癌細(xì)胞凋亡的結(jié)果相一致。因此，推測E2F-1過表達可通過對凋亡相關(guān)基因Skp2、Bax、Bcl-2和survivin產(chǎn)生影響從而對胃癌細(xì)胞及其移植瘤起抑制作用。

綜上所述，本實驗發(fā)現(xiàn)E2F-1過表達可抑制Skp2、Bcl-2和survivin的表達，促進Bax表達，這提示E2F-1極可能經(jīng)過這些基因的信號傳導(dǎo)通路發(fā)揮作用，引起胃癌細(xì)胞生物學(xué)行為發(fā)生改變，抑制胃癌的進展。

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The molecular mechanisms of human gastric cancer cell line MGC-803 proliferation suppressed by overexpression ofE2F-1 mediated by lentivirus

CAO Wen-long1, WEI Wei-yuan1, LUO Wen1, ZHANG Xiao-shi1, YAN Lin-hai1,XIE Yu-bo2, XIAO Qiang1*

(1.Dept. of Gastrointestinal and Gland Surgery;2.Dept. of Anesthesiology, the First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University, Nanning 530021, China)

ObjectiveTo study the molecular mechanisms of human gastric cancer cell line MGC-803 proliferation suppressed by overexpression ofE2F-1.MethodsThe experimental group(LV-E2F-1-GFP group),gastric cancer MGC-803 cells were transfected with recombinant lentivirirus vector (LV-E2F-1-GFP),the negative control group was transfected with negative control lentiviral vector (LV-GFP). The expression ofSkp2,Bax,Bcl-2 andsurvivinwere detected by semi-quantitative RT-PCR and Western blot method.ResultsCompared with LV-GFP group and blank control group,the mRNA levels ofSkp2,Bcl-2 andsurvivinin the LV-E2F-1-GFP group were reduced significantly(Plt;0.05),the protein levels ofSkp2,Bcl-2 andsurvivinin the LV-E2F-1-GFP group were reduced(Plt;0.05), the mRNA level ofBaxand the protein level ofBaxwere up regulated (Plt;0.05).ConclusionsThe proliferation of human gastric cancer MGC-803 cells is inhibited by overexpression ofE2F-1 mediated by lentivirus, the effect may be explained with down-regulation ofSkp2,survivin,Bcl-2 expression and up-regulation ofBaxexpression.

gastric cancer ; MGC-803 cells;E2F-1;overexpression

2013-08-21

2013-11-26

國家自然科學(xué)基金(30860273)；廣西科學(xué)技術(shù)攻關(guān)項目(桂科攻10124001A-22)；廣西自然科學(xué)基金(2013GXNSFAA019163)

*通信作者(correspondingauthor)： xiaoqiang20050@aliyun.com

1001-6325(2014)04-0459-05

研究論文

R 735.2

A