無雄激素條件下表皮生長因子誘導前列腺癌細胞系增殖及雄激素受體磷酸化

孫雪飛，趙 暉，李 揚，錢 筠，白雪燕，周永建，朱 紅，張 勇，劉元波,2*

(首都醫科大學 附屬北京天壇醫院 1.血液腫瘤科；2.輸血科；3.泌尿外科,北京，100050)

無雄激素條件下表皮生長因子誘導前列腺癌細胞系增殖及雄激素受體磷酸化

孫雪飛1#，趙 暉2#，李 揚1，錢 筠1，白雪燕1，周永建3，朱 紅1，張 勇3，劉元波1,2*

(首都醫科大學 附屬北京天壇醫院 1.血液腫瘤科；2.輸血科；3.泌尿外科,北京，100050)

目的探討在無雄激素的條件下，表皮生長因子對前列腺癌細胞增殖及雄激素受體磷酸化的影響。方法以LNCaP 及LAPC4 AR為研究對象，在無雄激素的條件下，EGF處理后， Western blot方法測定LNCaP 及LAPC4 AR磷酸化狀態;siRNA轉染方法敲除Src基因或Ack1基因,觀察對AR磷酸化的影響；CCK-8檢測細胞增殖；定時定量RT-PCR檢測前列腺特異抗原及人體激肽釋放酶2 mRNA表達。結果EGF通過Src激酶和另一未知激酶導致AR Tyr-534及AR Tyr-267特異位點磷酸化；相比未用EGF對照組，EGF能夠促進前列腺癌細胞增殖(Plt;0.05)，增加前列腺特異抗原(Plt;0.05)及人體激肽釋放酶2 mRNA表達(Plt;0.05)。結論EGF通過細胞內非受體酪氨酸激酶使AR特異位點磷酸化,誘導前列腺癌細胞增殖。

表皮生長因子；去勢抵抗性前列腺癌； 雄激素受體；酪氨酸激酶；磷酸化

前列腺癌的發生及發展與雄激素有密切關系，通過外科去勢(castration)或者藥物從患者體內剔除雄激素是治療前列腺癌的有效方法之一，但是, 患者最終對該治療失去作用并逐漸進展為去勢抵抗性前列腺癌(castration-resistant prostate cancer，CRPC)，其機制尚不完全明了。有研究表明，低睪酮環境下雄激素受體(androgen receptor，AR)激活在CRPC發病中起關鍵作用[1-4]。在閹割動物，AR的過度表達具有促進前列腺癌移植瘤的形成作用，AR敲除后便抑制其腫瘤源性[2]。AR激活可能存在多種機理，包括AR基因擴增，AR過度表達，AR點突變，AR共激活因子的過度表達以及腫瘤自身產生的雄激素等[5]。近年來有研究發現非雄激素依賴的細胞內信號傳導導致AR磷酸化是AR激活的重要途徑之一[3-4,6]。表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)通過增加AR與性激素受體轉錄介導因子2(transcriptional intermediary factor 2,TIF2)的相互作用而增強AR的轉錄活性，人表皮生長因子受體2(human epidermal receptor 2,HER2)通過增加AR蛋白穩定性及與DNA結合力而激活AR的轉錄功能[7]。有研究報道在難治性前列腺癌中，表皮生長因子(epidermal growth factor，EGF)能夠增加AR的活性[8]。本研究旨在探討，在無雄激素的條件下，EGF對前列腺癌細胞增殖及雄激素受體磷酸化的影響。

1 材料與方法

1.1 試劑

EGF(Ramp;D公司); AR Tyr-267位點磷酸化特異性多克隆抗體及AR Tyr-534位點磷酸化特異性抗體(美國北卡羅來那大學綜合腫瘤研究中心 Young E. Whang教授惠贈)；鼠抗-AR單克隆抗體(Biogenex公司)。Ack1-siRNA、Src-siRNA及陰性對照scrambled siRNA(Dharmacon RNA Technologies)。

1.2 細胞及分組

雄激素依賴性前列腺癌細胞系LNCaP與LAPC4 (美國菌種保藏中心)；分組為EGF處理組；DHT處理組；對照組。

1.3 AR磷酸化

在無雄激素環境下，EGF(100 ng/mL)處理LNCaP或LAPC-4細胞60 min，提取蛋白后Westernblot方法測定AR Tyr-267位點及Tyr-534位點磷酸化狀態。

1.4 轉染及基因敲除

利用轉染試劑siPort Lipid(Ambion公司),將100 nmol/L Ack1-siRNA或Src-siRNA及陰性對照scrambled siRNA轉染進入LNCaP或LAPC-4細胞，24 h后，給予EGF處理。

1.5 細胞增殖實驗

將104個/孔的LNCaP或LAPC-4細胞培養于96孔培養板，給予二氫睪酮(dihydrotestosterone,DHT 10 nmol/L)或EGF(100 ng/mL)培養3 d，按照CCK-8說明書步驟檢測細胞增殖情況。

1.6 定時定量RT-PCR

LNCaP及LAPC4細胞由EGF或DHT處理后，使用RNeasy Mini Kit(Qiagen公司)提取細胞總RNA，采用Taqman universal PCR體系(ABI)。引物及探針序列如下：PSAmRNA上游，5′-GGCAGCATT GAACCAGAGGAG-3′;PSA下游，5′-GCATGAACTTG GTCACCTTCTG-3′;PSA探針,5′-6-FAM-ATGACGTG TGTGCGCAAGTTCACCC-BHQ-1-3′;hK2上游,5′-GC CTTAGACCAGATGAAGACTCCA-3′;hK2下游,5′-GC CCAGGACCTTCACAACATC-3′;hK2探針,5′-6-FAM-TGACCTCATGCTGCTCCGCCTGT-BHQ-1-3′;GAPDH上游,5′-GTCATGGGTGTGAACCATGAGA-3′;GAPDH下游,5′-GGTCATGAGTCCTTCCACGATAC-3′;GAPDH探針,5′-6-FAM-CAGCCTCAAGATCATCAGCAATGC CTC-BHQ-1-3′。GAPDH為內參。

1.7 統計學分析

2 結果

2.1 EGF可誘導AR特異位點磷酸化

在無雄激素環境下，EGF可誘導LNCaP細胞及LAPC-4細胞AR Tyr-534和Tyr-267位點磷酸化(圖1)。

2.2EGF通過兩條不同的途徑導致AR兩個不同位點的磷酸化

通過siRNA轉染方法敲除LNCaP細胞Src基因后，可有效抑制EGF誘導的AR Tyr-534位點磷酸化(圖2A)。用同樣方法敲除已知的引起AR Tyr-267位點磷酸化的Ack1基因[4]，卻不能抑制EGF誘導的AR Tyr-267位點磷酸化(圖2B)。因此，EGF是通過兩條不同的途徑導致兩個不同位點的磷酸化：1)通過細胞內Src激酶導致AR Tyr-534位點磷酸化；2)通過Ack1以外未知的細胞內激酶導致AR Tyr-267特異位點磷酸化。

圖1 EGF誘導AR Tyr-534和Tyr-267位點磷酸化Fig 1 AR is phosphorylated at Tyr-267 and Tyr-534 after EGF stimulation

2.3在無雄激素的條件下，EGF能夠促進前列腺癌細胞增殖

在無雄激素的條件下，EGF和DHT處理的LNCaP細胞吸光度值均明顯高于對照組(Plt;0.01)，LAPC-4細胞中也得到相似結果(圖3)。

2.4EGF促進前列腺癌細胞PSA及hk2mRNA表達

EGF處理的LNCaP細胞PSAmRNA和hk2 mRNA表達水平均較對照明顯上調(Plt;0.01)，LAPC-4細胞中也得到相似結果(圖4)。

3 討論

近年來國外研究報道，低或無循環雄激素環境下前列腺癌細胞AR的磷酸化在CRPC發生中具有重要作用[3-4, 6, 9]，而AR磷酸化機制尚不完全清楚。目前認為細胞外配體通過與前列腺癌細胞表面存在的EGF受體家族，包括EGFR，HER2等結合，通過細胞內非受體激酶信號傳導最終導致AR磷酸化[1,4,6]。

A.Src knockdown inhibited AR phosphorylation at Tyr-534 induced by EGF; B.EGF-induced AR phosphorylation at Tyr-267 was not inhibited by Ack1 knockdown

圖2SrcsiRNA沉默對EGF誘導的ARTyr-534及ARTyr-267磷酸化的影響

Fig2TheinfluenceofSrcknockdownonEGF-inducedARTyr-534phosphorylationandARTyr-267phosphorylation

*Plt;0.05 compared with control圖3 在無雄激素的條件下，EGF刺激雄激素依賴性前列腺癌細胞增殖

*Plt;0.01 compared with control圖4 EGF促進前列腺癌細胞PSA及hK2 mRNA表達Fig 4 EGF increased PSA and hK2 mRNA expression

EGF可能通過Src激酶導致AR Try-534位點磷酸化[6]；Heregulin與HER2結合通過細胞內Ack1酪氨酸激酶而導致前列腺癌細胞AR Try-267位點磷酸化[4]。本研究發現EGF可誘導AR Tyr-534和Tyr-267位點磷酸化,當Src敲除后，EGF誘導AR Tyr-534位點的磷酸化能夠被抑制，說明Src激酶參與EGF下游信號通路，結果與報道[6]一致。然而，敲除引起AR Tyr-267位點磷酸化的Ack1基因，卻不能抑制EGF誘導的AR Tyr-267位點磷酸化，說明EGF誘導的AR Try-267位點磷酸化與heregulin通過Ack1激酶導致的AR Try-267位點磷酸化存在不同通路[4]，詳細機制正在進一步研究中。

在無雄激素的條件下，EGF處理前列腺癌細胞后，仍可刺激細胞增殖，并且接近DHT刺激下細胞的增殖水平；前期也有報道，無雄激素條件下，heregulin[9]、bombesin[10]、白介素6[11]均可刺激前列腺癌細胞增殖，說明在無雄激素的條件下，非雄激素配體能夠激活AR進而促進前列腺癌細胞增殖。AR靶基因PSA及hk2的表達可作為前列腺癌的腫瘤標志，與腫瘤負荷密切相關。無雄激素環境下，EGF處理的前列腺癌細胞的PSAmRNA及hk2 mRNA較對照顯著增高。

本項研究發現EGF通過Src酪氨酸激酶和另一Ack1激酶以外的途徑導致AR Tyr-534及Tyr-267位點磷酸化；在無雄激素存在環境下，促進前列腺癌細胞LNCaP及LAPC4增殖，增強前列腺癌細胞標志基因PSA及hk2 mRNA表達。結果提示EGF可能與CRPC發生有密切關系。通過動物實驗及人體腫瘤標本的AR磷酸化研究將進一步驗證本結果并將有助于最終揭示CRPC的發病機制。

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Proliferation and androgen receptor phosphorylation of prostate cancer cells induced by epidermal growth factor at the absence of androgen

SUN Xue-fei1#, ZHAO Hui2#, LI Yang1, QIAN Jun1, BAI Xue-yan1, ZHOU Yong-jian3,ZHU Hong1, ZHANG Yong3, LIU Yuan-bo1,2*

(1.Dept. of Hematology and Oncology; 2.Dept. of Blood Transfusion; 3.Dept. of Urological Surgery, Beijing TianTan Hospital,Capital Medical University, Beijing 100050, China)

ObjectiveTo investigate the effect of epidermal growth factor on the proliferation and androgen receptor phosphorylation of prostate cancer cells in the absence of androgen.MethodsLNCaP and LAPC4 AR were used for the study, after EGF treatment,Western blot was used to detect AR phosphorylation in LNCaP and LAPC4 cells; Src and Ack1 genes with siRNA transfection were knocked down to observe the effect on androgen receptor phosphorylation; Cell Counting Kit-8(CCK-8) was used to measure the cell proliferation; Quantitive RT-PCR was used to analyze the expression of prostate-specific antigen and human kallikrein-2 mRNA.ResultsEGF can induce AR specific site phosphorylation at Try-534 and Try-267 by Src kinase and another unknown kinase; Compared with untreated control, EGF enharced the proliferation of prostate cancer cells(Plt;0.05) and increase the expression of prostate-specific antigen(Plt;0.05) and human kallikrein-2(Plt;0.05).ConclusionsEGF can induce proliferation and AR phosphorylation of prostate cancer by intracellular non-receptor tyrosine kinases

epidermal growth factor; castration-resistant prostate cancer; androgen receptor; tyrosine kinase;phosphorylation

2013-07-05

2013-09-26

國家自然科學基金(81272842，81302594)

*通信作者(correspondingauthor)： ybliu1955@163.com

#對本文有相同貢獻

1001-6325(2014)03-0305-05

研究論文

R 737.25

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