P38抑制劑SB203580對大鼠腦缺血再灌注后AQP4 表達及腦水腫的影響

王耀輝，李國輝，袁 微

(1.桂林醫學院 研究生學院，廣西 桂林 541004； 2.桂林醫學院 附屬梧州市紅十字會醫院 神經內科， 廣西 梧州 543002)

P38抑制劑SB203580對大鼠腦缺血再灌注后AQP4 表達及腦水腫的影響

王耀輝1，李國輝2*，袁 微1

(1.桂林醫學院 研究生學院，廣西 桂林 541004； 2.桂林醫學院 附屬梧州市紅十字會醫院 神經內科， 廣西 梧州 543002)

目的探討P38絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)抑制劑SB203580對大鼠腦缺血再灌注后腦組織水通道蛋白4(AQP4) 表達及腦水腫的影響。方法SPF 級雄性SD 大鼠54只，隨機分為假手術組(sham組)、模型組(I/R組)和P38抑制劑組(SB203580組)。用線栓法制備大鼠局灶性腦缺血再灌注模型。模型組與P38抑制劑組分別于造模前15 min舌下靜脈注射10%二甲基亞砜(DMSO,400 μg/kg)和P38抑制劑(SB203580,400 μg/kg)。缺血2 h再灌注24 h后對大鼠進行神經功能缺損評分，采用HE染色觀察大鼠腦組織病理改變，干濕比重法測定缺血半球的腦含水量，Western blot 檢測磷酸化P38(p-P38) 和AQP4 蛋白的表達、RT-PCR法檢測AQP4 mRNA的表達。結果與I/ R組相比，SB203580組大鼠神經功能缺損癥狀明顯改善，缺血側半球腦含水量明顯降低(Plt;0.05)。I/ R組大鼠缺血周邊區腦組織p-P38、AQP4蛋白 及mRNA 的表達分別為2.463±0.138、2.660±0.130及1.065±0.125，高于SB203580組的1.653±0.105、1.771±0.092及0.552±0.069 (Plt;0.05)。結論P38抑制劑SB203580減輕大鼠腦缺血再灌注后AQP4表達及腦水腫，其機制可能與SB203580抑制P38信號通路的激活降低了下游AQP4的表達有關。

腦缺血再灌注；腦水腫；水通道蛋白4；P38；SB203580

P38是絲裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase, MAPK)家族的一員，在細胞水腫中起著重要作用。研究表明，抑制P38的激活可降低星形膠質細胞AQP4(aquaporin 4)表達及細胞水腫[1]。本研究應用4-(4-氟苯)-2-(4-(甲磺酰苯)-5-(4-吡啶基)-1氫-咪唑(SB203580)抑制腦缺血再灌注大鼠P38通路的激活，觀察SB203580對大鼠腦缺血再灌注后水通道蛋白4(aquaporin 4,AQP4)表達及腦水腫的影響，探討其作用的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與試劑

SPF級雄性SD大鼠(體質量240～260 g)，由廣西醫科大學實驗動物中心提供，合格證號：SCXK (桂) 2009-0002。4-(4-氟苯)-2-(4-(甲磺酰苯)-5-(4-吡啶基)-1氫-咪唑(SB203580)(Selleck公司)，二甲基亞砜(DMSO)(Sigma公司)，抗總P38抗體、抗p-P38抗體和抗AQP4抗體(Santa Cruz公司)，抗β-actin抗體、羊抗兔IgG抗體(碧云天公司)，RT-PCR反轉錄試劑盒(TAKARA公司)。

1.2 局灶性腦缺血再灌注模型制備

大鼠54 只，隨機分成3組(n=18只)：假手術組、模型組和P38抑制劑組。模型組和P38抑制劑組分別在制備局灶性腦缺血再灌注模型前15 min通過舌下靜脈注射10%二甲基亞砜(DMSO，400 μg/kg)和P38抑制劑(SB203580，400 μg/kg)。用改良的Zea-Longa 線栓法[2]制備局灶性腦缺血再灌注模型。假手術組：手術操作同模型組，但線栓插入深度lt;9 mm，不做腦梗死。

1.3 大鼠神經功能缺損評分

大鼠經缺血2 h再灌注24 h后，參照Zea-Longa 法[2]對其進行神經功能缺損評分：0 分，無神經功能缺損癥狀；1 分，對側前爪不能完全伸展；2 分，向對側轉圈；3分，向對側傾倒；4 分，不能自發行走。造模成功的標志：神經功能缺損評分1～3分，且斷頭取腦后大腦中動脈無出血或血管內血栓形成。

1.4 組織切片制備及HE染色

缺血2 h再灌注24 h，麻醉大鼠，先后4 ℃ 0.9%氯化鈉注射液100 mL、4%多聚甲醛150 mL心臟灌洗，取腦，固定、石蠟包埋，HE染色。

1.5 腦組織含水量測定

缺血2 h再灌注24 h，麻醉后迅速取腦，用錫箔紙包裹。稱濕重后，將腦組織置于100 ℃恒溫干燥箱中，烘干24 ～48 h至恒重，是為干重。計算腦含水量：腦含水量(BWC)=(濕重-干重)/濕重×100%。

1.6Westernblot檢測腦組織p-P38、P38和AQP4的表達

缺血2 h再灌注24 h，麻醉后，于冰上切取缺血周邊區皮層腦組織。提取總蛋白，制備SDS-PAGE凝膠，加樣電泳。濕轉法將蛋白條帶轉移至PVDF膜上，置入封閉液中(5%脫脂奶粉)常溫封閉1 h，封閉后加一抗P38(1∶1 000)、p-P38(1∶1 000)、AQP4(1∶300)及β-actin(1∶500)抗體，4 ℃孵育過夜，加入HRP標記的二抗(羊抗兔IgG，1∶1 000)，37 ℃孵育1 h，ECL曝光、顯影及定影。以β-actin作為內參。光片掃描后用Quantity One系統分析吸光度， p-P38/P38的比值記為p-P38的表達水平，AQP4/β-actin的比值記為AQP4的表達水平。

1.7 RT-PCR 檢測AQP4 mRNA 的表達

按照Trizol試劑說明提取總RNA，按反轉錄試劑盒進行反轉錄。產物進行PCR擴增。以β-actin為內參。AQP4[3]上游引物：5′-TTGGACCAATCATA GGCGC-3′，下游引物：5′-GGTCAATGTCGATCACAT GC-3′(擴增片段長度255 bp)。β-actin上游引物：5′-TTCGCGGGCGACGATGC-3′，下游引物為：5′-CGA AGTCCAGGGCGAC-3′(擴增片段長度為609 bp)。擴增條件：94 ℃變性5 min，94 ℃ 30 s，59 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，72 ℃延伸10 min。AQP4及β-actin各30個循環。RT-PCR 產物以1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，長波紫外燈下觀察拍照。Quantity One 系統分析吸光度，AQP4/β-actin 的比值記為AQP4 mRNA表達水平。

1.8 統計學分析

2 結果

2.1 神經功能評分的結果

假手術組大鼠神經功能正常。模型組大鼠神經功能缺損明顯(Plt;0.05)；P38抑制劑組有改善(Plt;0.05)(表1)。

2.2 腦組織病理改變的結果

假手術組大鼠腦組織結構正常， 胞質及胞核清晰。模型組神經細胞體積縮小，胞質疏松，核固縮，凋亡小體形成。與模型組相比，P38抑制劑組神經細胞壞死程度較輕(圖1)。

2.3 腦組織含水量的結果

假手術組大鼠腦組織有一定的含水量。與假手

術組相比，模型組和P38抑制劑組大鼠腦組織含水量增加 (Plt;0.05)；與模型組相比，P38抑制劑組大鼠腦組織含水量減少 (Plt;0.05)(表1)。

表1 SB203580對各組大鼠神經功能評分及腦含水量的影響Table 1 The effect of SB203580 on cerebral edema and neurological function in each group

*Plt;0.05 compared with sham group;#Plt;0.05 compared with I/R group.

2.4腦組織p-P38與AQP4蛋白及AQP4mRNA表達的結果

與假手術組相比，模型組大鼠缺血周邊區腦組織p-P38的表達增加(Plt;0.01)，AQP4和AQP4 mRNA的表達上調(Plt;0.01)；與模型組相比，P38抑制劑組大鼠缺血周邊區腦組織p-P38的表達減少(Plt;0.01)，AQP4和AQP4 mRNA的表達下調(Plt;0.01)(表2;圖2,3,4)。

A.sham group； B.I/R group； C.SB203580 group圖1 SB203580對缺血腦組織病理學改變的影響Fig 1 The effect of SB203580 on ischemic brain tissue pathology(×200)

表2 SB203580對缺血腦組織內AQP4蛋白和mRNA表達及P38MAPK磷酸化水平的影響Table 2 The effect of SB203580 on AQP4, AQP4 mRNA and p-P38 expression in ischemic brain tissue(±s,n=6)

*Plt;0.05 compared with sham group;#Plt;0.05 compared with I/R group.

圖2 SB203580對腦缺血周圍組織內p-P38水平的影響Fig 2 The effect of SB203580 on the level of p-P38 in the surrounding tissues of cerebral ischemia

圖3 SB203580對腦缺血周圍組織內AQP4表達的影響Fig 3 The effect of SB203580 on AQP4 expression in the surrounding tissues of cerebral ischemia

圖4 SB203580對腦缺血周圍組織內AQP4 mRNA表達的影響Fig 4 The effect of SB203580 on AQP4 mRNA expression in the surrounding tissues of cerebral ischemia

3 討論

P38 MAPK廣泛分布于生物體內，可被炎性反應、氧化應激和缺血缺氧等激活，在神經系統疾病的信號傳導中發揮重要作用[4]。AQP4是中樞神經系統的主要水通道蛋白，在腦組織水平衡的調節中起到關鍵作用[5]。研究表明，AQP4的高表達與細胞毒性腦水腫程度呈正相關[6]，調節星形膠質細胞AQP4的表達可減輕腦水腫的程度[7]。本研究發現，與假手術組相比，模型組大鼠缺血周邊區腦組織p-P38、AQP4及AQP4 mRNA的表達增高且伴腦水含量的增加，提示腦缺血再灌注損傷后P38信號通路被激活，致使AQP4高表達，進而增加腦含水量。

P38的激活對缺血性腦卒中后腦水腫起著重要作用，抑制P38的激活可有效減輕腦水腫[8]。SB203580是P38的特異性抑制劑，通過股靜脈注射SB203580可以抑制P38的激活[9]。舌下靜脈較股靜脈表淺，不會由于操作損傷大鼠的肢體運動功能，可避免操作對神經功能缺損評分的影響。因此，本研究采用舌下靜脈注射SB203580的方式抑制P38的激活。以往研究發現，阻斷P38的激活可以降低星形膠質細胞氧糖剝奪/復氧模型中AQP4及AQP4 mRNA的表達[10]，減輕大鼠腦創傷后腦水腫的程度[9]。本研究發現，與模型組相比，P38抑制劑組大鼠缺血周邊區腦組織p-P38、AQP4及AQP4 mRNA的表達降低且伴腦含水量減少，提示P38抑制劑SB203580抑制P38的激活，導致AQP4的表達下調，減少腦含水量。

綜上所述， SB203580可以降低大鼠腦缺血再灌注后AQP4的表達及腦水腫的形成，其作用機制可能與抑制P38激活、降低下游AQP4的表達有關。然而，SB203580對腦缺血再灌注后AQP4表達及腦水腫形成的具體作用機制仍有待于進一步研究。

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P38 MAPK inhibitor SB203580 decreases the AQP4 expression and cerebral edema of rats after cerebral ischemia and reperfusion

WANG Yao-hui1, LI Guo-hui2*, YUAN Wei1

(1.Graduate School of Guilin Medical College, Guilin 541004; 2.Dept. of Neurology, Wuzhou Red Cross Hospital, Wuzhou 543002, China)

ObjectiveTo explore the role of P38 inhibitor SB203580 on cerebral edema and Aquaporin 4(AQP4) expression after cerebral ischemia reperfusion in rats.MethodsFifty-four SPF male Sprague-Dawley rats weighing 240-260 g were randomly divided into 3 groups: sham operation group(sham grope); ischemia reperfusion group(I/R group); P38 inhibitor group(SB203580 group).The focal ischemia reperfusion rat model was established by the modified suture method. The rats of I/R group and SB203580 group were exposed to DMSO(10%,400 μg/kg) or P38 inhibitor SB203580(400 μg/kg) 15 min before suffered from cerebral ischemia. Neurologic function was scored at 24 h reperfusion after 2 h ischemia. HE staining was used to examine brain tissue injury, wet-dry ratio was measured to estimate cerebral edema, Western blot was used to detect the expression of p-P38 and AQP4, RT-PCR was used to detect AQP4 mRNA.ResultsP38 inhibitor SB203580 improved behavioral scores of ischemic reperfusion rats. The brain water content was decreased after SB203580 treatment compared with I/R group(0.792±0.010vs0.817±0.012). The expression of p-P38, AQP4 and AQP4 mRNA in margin of infarction of SB203580 group are decreased as compared with I/R group compared with I/R group.ConclusionsP38 inhibitor SB203580 alleviates AQP4 expression and cerebral edema in cerebral ischemia reperfusion rats through P38 MAPK pathway.

cerebral ischemia reperfusion; cerebral edema; aquaporin 4; P38;SB203580

2013-07-01

2013-09-24

*通信作者(correspondingauthor)： wzhhgh@163.com

1001-6325(2014)03-0381-05

研究論文

R 743

A