高磷對維持性血液透析透患者微炎性反應和氧化應激的影響及機制

陳艷紅，陳 星，成梅初，袁 芳，陳俊香，劉伏友

(1.中南大學 湘雅二醫院 腎內科, 湖南 長沙 410011； 2.湖南省人民醫院 SICU， 湖南 長沙 410005)

高磷對維持性血液透析透患者微炎性反應和氧化應激的影響及機制

陳艷紅2，陳 星1*，成梅初1，袁 芳1，陳俊香1，劉伏友1

(1.中南大學 湘雅二醫院 腎內科, 湖南 長沙 410011； 2.湖南省人民醫院 SICU， 湖南 長沙 410005)

目的探討高磷對維持性血透患者微炎性反應及氧化應激的影響及機制。方法實驗分A組(正常人對照組)，B組(維持性血透患者組即Maintenance hemodialysis，MHD)，C組(不同磷酸二氫鈉濃度劑量組 1.5 mmol/L、 C2 2.5 mmol/L及C3 5.5 mmol/L)，D組(5.5 mmol/L磷酸二氫鈉作用不同時間組D1 6 h、D2 12 h及D3 24 h)和E組(無磷酸二氫鈉作用空白組E1 6 h、E2 12 h及E3 24 h組)。用real-time PCR及Western blot分別檢測外周血單個核細胞NF-κB P65及NOX2/gp91的表達。ELISA檢測血漿及細胞培養液上清IL-6含量，硫氮巴比妥酸法檢測MDA含量。結果MHD組PBMC中NF-κBP65、NOX2 mRNA及phospho-NF-κBP65、NOX2 蛋白表達及血漿IL-6、MDA水平明顯高于正常組；磷酸二氫鈉作用下，培養液上清IL-6、MDA產生呈劑量、時間依賴性增加(Plt;0.05)。NF-κB P65 mRNA、phospho-NF-κBP65蛋白和NOX2/gp91 mRNAN及蛋白水平表達呈劑量、時間依賴性上調(Plt;0.05)；NF-κB P65mRNA及phospho-NF-κB P65蛋白表達與培養液上清IL-6產生呈正相關， NOX2/gp91mRNA及蛋白表達與培養液上清MDA產生呈正相關。結論高磷可能通過活化NF-κBP65、NOX2/gp91信號通路介導炎性介質、氧化應激產物產生增加，高磷血癥可能為MHD患者微炎性反應狀態和氧化應激狀態的危險因素。

維持性血液透析；高磷血癥；微炎性反應；氧化應激

心血管并發癥是維持性血透(maintenance hemodialysis，MHD)患者首要死亡原因。MHD患者死于心血管疾病 (cardiovascular disease，CVD)約達50%[1]。大量研究認為高磷血癥是導致MHD患者血管鈣化的主要原因[2-4]，是MHD患者并發心血管病變的關鍵因素。微炎性反應和氧化應激狀態是MHD患者并發心血管病變的重要因素。MHD患者普遍存在高磷血癥、微炎性反應和氧化應激狀態。高血磷在CKD患者炎性反應狀態的發展中起了重要作用[5]。目前MHD患者高磷血癥與氧化應激及微炎性反應狀態的關系及機制尚不清楚。本研究通過高磷干預MHD患者單個核細胞，觀察NF-ΚB P65、NADPH亞型(NOX2)的mRNA及蛋白表達水平及IL-6、MDA的產生變化，初步探討高磷對炎性介質及氧化應激產物的影響及其機制。進一步深入認識高磷的危害，為預防和治療MHD患者高磷所致心血管病變提供新思路。

1 材料與方法

1.1 研究對象

1.1.1 入選標準：中南大學湘雅二醫院血液凈化中心MHDA患者(透析6個月以上)38例(簽署知情同意書)，年齡30～65歲，肝功能、血常規、血脂正常。透析方案：維持性碳酸氫鹽血液透析治療，每周透析3次，每次4 h，使用貝郎Dialog+血液透析機，透析液流量500 mL/min，血流量200～300 mL/min，一次性血仿膜透析器(貝郎公司)，血管通路為動靜脈內瘺。排除標準：1)穩定血液透析lt;6個月；2)急、慢性肝臟疾病，急、慢性感染，惡性原腫瘤，自身免疫性疾病；3)近3個月內有輸血史或手術史；4)近1個月內有靜脈補充鈣劑史，使用糖皮質激素、鐵劑和降脂藥。體檢正常人20例。

1.1.2 實驗分組：正常組(A組)：20例；MHD患者組(B組)即：隨機選取符合入選標準的MHD患者38例MHD患者中20例。余下18例隨機分成C、D及E組，每組6例。C組：3個濃度不同磷酸二氫鈉作用組1.5、 2.5和 5.5 mmol/L；D組：5.5 mmol/L磷酸二氫鈉作用6、12和24 h；E組：無磷酸二氫鈉作用組，常規培養6、12和24 h。

1.2 主要試劑

RPMI-1640培養基(Gibco公司)；胎牛血清(杭州四季青公司)；兔抗人phospho-NF-κB P65 (Ser536)多克隆抗體(CST公司)；兔抗人NOX2/gp91phox多克隆抗體(北京博奧森生物技術有限公司)；鼠抗人β-actin多克隆抗體，辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)標記抗小鼠二抗、抗兔二抗、抗山羊二抗(中杉金橋公司)；Trizol試劑盒、SYBR green試劑盒(Invitrogen公司)；組織細胞蛋白裂解液RIPA(北京鼎國生物公司)；反轉錄試劑盒(RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit)(Fermentas公司)；PCR引物由上海生物工程公司合成；ECL顯影劑、PVDF膜(Millipore公司)。IL-6 ELISA試劑盒(Ramp;D公司)；MDA試劑盒(南京建成)。

1.3 細胞培養與干預

用Ficoll密度梯度法分離MHD患者及正常人外周血單個核細胞及血漿。使用1640+10%胎牛血清培養基，37 ℃，5% CO2條件下培養。首先用1.5、2.5和5.5 mmol/L 3個不同濃度的磷酸二氫鈉作用MHD患者PBMC 24 h后分離培養液上清及細胞。接下予高濃度5.5 mmol/L磷酸二氫鈉干預，作用時間不同(6、12和24 h)，檢測 PBMC細胞NF-κB P65及NOX2蛋白及mRNA表達變化，及培養液上清IL-6、MDA產生變化。

1.4 檢測方法

1.4.1 IL-6的檢測：收集正常組和MHD血透組患者的血漿及培養液上清，-80 ℃保存，ELISA方法檢測。

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1.4.2 MDA的檢測：血清和細胞上清中的MDA，采用硫代巴比妥酸比色法，嚴格遵說明說操作。

1.4.3 Western印跡檢測PBMC NF-κB P65、NOX2蛋白表達：將PBMC加入50 μL預冷的組織細胞裂解液[使用前加入濃度1/100的苯甲基磺酰氟化物(phenylmethyl sulfonylfluoride，PMSF)]冰上裂解30 min。裂解液4 ℃，12 000r/min離心10 min，上清液移入新的1.5 mL離心管中，用二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)蛋白檢測試劑盒測定蛋白濃度。按照常規Western blot方法對上述各組phospho-NF-κB P65、NOX2及β-actin進行檢測。以所測得的各條帶的吸光度與內參照β-actin吸光度的比值代表定量值。

1.4.4 Real-time PCR檢測PBMC NF-κB P65、NOX2 mRNA 表達：按Trizol試劑說明書抽提PBMC總RNA。按標準步驟進行反轉錄，所得cDNA進行real-time PCR實驗。

1.5 統計學分析

2 結果

2.1 各組血漿及培養液上清中IL-6和MDA變化

MHD患者血漿IL-6、MDA水平明顯高于正常人(A組)(表1)；C組：磷酸二氫鈉作用于MHD患者PBMC，培養上清IL-6、MDA產生呈劑量依賴性增加；D組：5.5 mmol/L磷酸二氫鈉作用后培養上清IL-6、MDA產生呈時間依賴性增加(表2)。

2.2各組PBMCNF-κBP65、NOX2/gp91mRNA表達變化

2.2.2 C組中3個亞組PBMC中NF-κB P65和NOX2/gp91 mRNA表達水平：不同濃度磷酸二氫鈉作用24 h：NF-κB P65、NOX2/gp91 mRNA表達呈上調呈劑量依賴性上調(圖2)。

2.2.3 D和E組其各亞組NF-κB P65和NOX2/gp91 mRNA表達水平：高濃度(5.5 mmol/L)磷酸二氫鈉作用6、12和24 h：NF-κB P65和NOX2/gp91 mRNA表達水平呈時間依賴性增高(圖3)。

表1 正常組與MHD組血漿L-6和MDA變化Table 1 The lever of plasma IL-6 and MDA of different

*Plt;0.05 compared with normal control group.

表2 各組培養液上清中IL-6和MDA變化Table 2 The results of IL-6 and MDA of different

*Plt;0.01 compared with 1.5 mmol/L phosphate concentration group;#Plt;0.01 compared with high phosphate concentration stimulated 6 hours group.

*Plt;0.01 compared with normal control group圖1 MHD患者PBMC中NF-κB P65、NOX2/gp91mRNA表達情況Fig 1 The NF-κB P65 mRNA and NOX2/gp91 mRNA expression of in PBMCs of MHD patients

*Plt;0.01 compared with 1.5 mmol/L phosphate concentration guoup圖2 不同濃度磷酸二氫鈉干預NF-κB P65、NOX2/gp91表達變化Fig 2 The influence of the expression of the NF-κB P65 and NOX2/gp91 mRNA by different of phosphate concentration

*Plt;0.01 compared with high phosphate concentration stimulated 6h group圖3 高濃度磷酸二氫鈉作用不同時間P65、NOX2/gp91表達變化Fig 3 The influence of the expression of the NF-κB P65 and NOX2/gp91 mRNA by High phosphate concentration

2.3Phospho-NF-κBP65、NOX2/gp91蛋白含量變化

2.3.1 A和B組PBMC中phospho-NF-κB P65和NOX2/gp91蛋白表達水平：MHD患者PBMC中phospho-NF-κBP65、NOX2/gp91蛋白表達顯著上調(Plt;0.01)(圖4)。

圖4 MHD患者PBMC中phospho-NF-κBP65、NOX2/gp91 蛋白表達變化Fig 4 Phospho-NF-κB P65 protein and NOX2/gp91 protein expression of in PBMCs of MHD patients

2.3.2 C組中3亞組PBMC中phospho-NF-κB P65和NOX2/gp91 蛋白表達水平：不同濃度磷酸氫二鈉鈉作用PBMC 24 h：phospho-NF-κB P65、NOX2/gp91 蛋白表達呈劑量依賴性上調C2、C3與C1組比較，差異有統計學意義(Plt;0.01);C3與C2比較差異有統計學意義(Plt;0.01)(圖5)。

圖5 不同濃度磷酸二氫鈉作用phospho-NF-κB P65、NOX2/gp91蛋白表達變化Fig 5 The influence of the expression of phospho- NF-κB P65 and NOX2/gp91 protein by different of phosphate concentration

2.3.3 D和E組中各亞組PBMC的phospho-NF-κB P65和NOX2/gp91蛋白表達水平：高濃度(5.5 mmol/L)磷酸二氫鈉作用不同時間(6、12和24 h)，phospho-NF-κB P65、NOX2/gp91蛋白表達呈時間依耐性上調D2、D3與D1比較有統計學差異(Plt;0.01)，D3與D2比較有統計學差異(Plt;0.01)，E組間無統計學差異(Pgt;0.05)(圖6)

圖6 高濃度5.5 mmol/L磷酸二氫鈉作用不同時間phospho-NF-κB P65、NOX2/gp91蛋白表達變化Fig 6 The influence of the expression of phospho- NF-κB P65 and NOX2/gp91 protein by High phosphate concentration

2.4 相關指標間的相關性

MHD患者PBMC NF-κB P65 mRNA及phospho-NF-κB P65蛋白表達與培養液上清IL-6濃度呈正相關，相關系數分別為r=0.741、r=0.934(Plt;0.01)； NOX2/gp91 mRNA及蛋白表達與培養液上清MDA濃度呈正相關，相關系數分別為：r=0.723，r=0.689(Plt;0.01)。

3 討論

核因子κB(NF-κB)是廣泛表達的炎性轉錄因子。P65通過蛋白磷酸酶2A去磷酸化后，NF-κB活性降低[6]。因此檢測磷酸化的P65可以反應NF-κB的活化程度。

本研究顯示MHD患者PBMC NF-κB的活性明顯高于健康人，提示MHD患者 NF-κB信號途徑過度活化，與其他作者報道一致[7]。這可能與長期血液透析、透析膜、透析水純度及體內微炎性反應、氧化應激狀態相關。本研究顯示高磷可誘導MHD患者PBMC NF-κB活化，并呈濃度時間依賴性，NF-κB P65 mRNA、phospho-NF-κB P65蛋白表達與培養液上清IL-6濃度呈正相關。提示高磷可能通過活化NF-κB信號通路使IL-6的產生增多。提示MHD患者高磷與微炎性反應相關，高磷可能通過活化NF-κB促進炎性介質的產生。

NADPH氧化酶/NOX家族蛋白是生成ROS的重要來源，并可引起多種心血管疾病[8]。NADPH氧化酶(NOX)在單核細胞上主要表達NOX2(gp91phox)，NOX2被認為是NADPH氧化酶的催化核心[9]。激活的NOX2，可致氧化應激[10]。

本研究顯示MHD患者PBMC的NOX2表達及血漿MDA水平明顯高于健康人，提示MHD患者處于氧化應激狀態，與其他作者報道一致[11]。MHD患者氧化應激增強與體內某些毒性物質蓄積有關，如晚期氧化蛋白產物，不僅能誘導氧化應激，本身又是氧化應激的產物。本研究首次顯示高磷可誘導MHD患者PBMC NOX2 mRNA及蛋白表達上調，且培養上清液MDA含量增多，呈時間和劑量依賴性， NOX2/gp91 mRNA及蛋白表達與培養上清液MDA濃度呈正相關。提示高磷可能通過上調 NOX2的表達，增加MDA產生，加重MHD患者氧化應激狀態。因此高磷可能為MHD患者氧化應激增強的一個重要因素。高磷誘導平滑肌細胞線粒體勢能改變增加ROS產生[12]，高磷誘導氧化應激可能通過了不同的分子機制，這點有待進一步研究。

總之，本研究一方面提示高磷可誘導NF-κB信號通路活化，促進IL-6產生增加，加重MHD患者微炎性反應狀態。另一方面提示高磷可誘導NOX2 mRNA及蛋白的表達，增加MDA的產生，加重MHD患者氧化應激狀態。高磷可能為MHD患者微炎性反應和氧化應激狀態的危險因素。因此提示可從高磷誘導微炎性反應及氧化應激角度考慮開拓新途徑、新方法以減輕及預防高磷導致的心血管病變。

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The effect and mechanism of high phosphorus concentration on microinflammatory and oxidative stress response in maintenance hemodialysis patients

CHEN Yan-hong2, CHENG Xing1*, CHENG Mei-chu1, YUAN Fang1, CHEN Jun-xiang1, LIU Fu-you1

(1.Dept. of Nephrology, the Second Xiangya Hospital of Central South University, Changsha 410011；2.Dept. of SICU,Hunan Provincial People’s Hospital, Changsha 410005, China)

ObjectiveTo investigate the effect of high phosphate on mRNA and protein expression of intracellular NF-κB and NOX2/gp91 in PBMC of MHD patients and serum inflammation mediators and MDA production，so as to understand the possible relationship among hyperphosphatemia, micro-inflammatory states and oxidative stress.MethodsThey were divided into five groups: control, MHD, dose, time and blank groups.Western blot and Real-time PCR were respectively used to determine the mRNA and protein expression of NF-κB P65,NOX2.The concentration of IL-6 in the culture supernatant was quantified by the ELISA kit and the TBA assay kit．ResultsNF-κB and NOX2 signal pathway in PBMCs show abnormal activation status in MHD patients. Both expression of NOX2/gp91 mRNA and protein levels increased dose-and time-dependent manners totally. IL-6 and MDA production in supernatant up-regulate dose-and time-dependent manners totally. NF-κB P65 mRNA and phospho-NF-κB 65 protein were positively correlated with IL-6 production. NOX2/gp91 mRNA and protein expression were positively correlated with MDA production.ConclusionsHigh phosphate may increase the production of supernatant IL-6 and MDA by activating NF-κB and NOX2 signaling pathway in PBMCs, thus could be a risk factor for microinflammatory and oxidative stress status of MHD patients.

maintenance hemodialysis; hyperphosphatemia; microinflammatory; oxidative stress

2013-06-04

2013-10-09

*通信作者(correspondingauthor)： c.x1030@163.com

1001-6325(2014)03-0386-05

研究論文

R 692.5

A