單例先天性小耳殘耳軟骨細胞體外構建人耳廓軟骨

康 寧，劉 霞，曹誼林，肖 苒

(中國醫學科學院 整形外科醫院 研究中心， 北京 100144)

研究論文

單例先天性小耳殘耳軟骨細胞體外構建人耳廓軟骨

康 寧，劉 霞，曹誼林，肖 苒*

(中國醫學科學院 整形外科醫院 研究中心， 北京 100144)

目的探討單例先天性小耳殘耳軟骨細胞體外構建正常人大小耳廓形態組織工程軟骨的可行性。方法分離40例小耳畸形患者殘耳軟骨細胞統計細胞提取率；MTT法檢測細胞增殖能力、計算擴增效率；免疫熒光和PCR檢測不同代數細胞的軟骨表型。分別應用3例患者各自的殘耳軟骨細胞培養至P3～P4代，藻酸鹽凝膠包埋接種于正常人大小耳廓形態的聚羥基乙酸/聚乳酸支架，體外成軟骨誘導動態培養10周后行組織學染色觀察。結果耳軟骨細胞提取率為(3.90±1.27)×106/g；在增殖培養基中細胞增殖能力明顯提高，至P4代擴增(328.4±50.4)倍(Plt;0.05)；P3代細胞Ⅱ型膠原、蛋白聚糖表達顯著減弱，至P4代消失，Ⅰ型膠原表達增強；體外培養10周，實驗組形成了耳廓形態的類軟骨組織，可見典型軟骨陷窩，番紅O、甲苯胺藍及Ⅱ型膠原染色陽性；對照組明顯變形，未形成軟骨結構。結論單例先天性小耳殘耳軟骨細胞經體外擴增和動態誘導培養可在體外構建正常人大小耳廓軟骨。

先天性小耳畸形；殘耳軟骨細胞；耳廓形態軟骨；組織工程

先天性小耳畸形是整形外科涉及軟骨組織缺損的常見疾病，發病率約1.4/萬。目前治療多為自體肋軟骨移植或假體植入，但造成供區損傷或存在外露、感染等風險。應用組織工程技術構建人耳廓軟骨是組織工程向臨床應用轉化的重要研究方向之一。殘耳軟骨組織取材簡便，不損傷正常生理結構，是一種極具應用價值的種子細胞來源。多項研究表明[1-3]，應用殘耳軟骨細胞構建的組織工程軟骨與生理軟骨相比組織學水平未見明顯差異，為采用殘耳軟骨細胞進行外耳廓重建提供了有力依據。本實驗初步證實應用單例患者來源的殘耳軟骨細胞體外構建人耳廓軟骨的可行性，以為未來的臨床應用提供理論基礎與技術參數。

1 材料與方法

1.1 樣本來源

經本院倫理委員會同意，樣本取自Ⅲ期耳廓再造術中廢棄的殘耳軟骨，患者年齡7～25歲，共40例，均已知情同意。

1.2 主要試劑和因子

堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor, b-FGF)(Peprotech公司)，轉化生長因子β1(transforming growth factor-β1, TGF-β1)(Peprotech公司)，胰島素鐵硒傳遞蛋白(insulin-transferrin-selenium, ITS)(Sigma公司)，維生素C，地塞米松，噻唑藍[3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide, MTT, Sigma公司]，兔抗人Ⅱ型膠原多克隆抗體、羅丹明-羊抗兔IgG(中杉金橋公司)。

1.3 殘耳軟骨細胞的分離培養和細胞提取率

將剝離軟骨膜的殘耳軟骨稱重記錄。切成2 mm×2 mm×2 mm小塊以0.25%胰蛋白酶消化20 min，0.2% Ⅳ型膠原酶37 ℃搖床消化8～12 h，200目濾網過濾，2 000r/min離心8 min，錐蟲藍染色檢查細胞活力并計數，計算初始細胞提取率。以 1.5×104個/cm2的密度接種，分別以普通培養基(DMEM-LG, 10%胎牛血清, 100 U/mL青霉素，0.1 mg/mL鏈霉素)和增殖培養基(普通培養基加入10 ng/mL bFGF)培養，4 d傳代1次。

1.4 細胞增殖能力檢測

1.4.1 MTT比色法繪制生長曲線：取普通培養基培養的P1代及增殖培養基培養的P1～P4代殘耳軟骨細胞，按細胞1 000個/孔接種96孔板，加MTT溶液(5 g/L，pH 7.4)37 ℃4 h后以DMSO溶解結晶，490 nm波長處測定吸光度值。

1.4.2 細胞增殖倍數計算：在普通和增殖培養基培養下，分別于原代接種及第4代末行細胞計數。細胞增殖倍數：P=M最終/ M初始。

1.5 軟骨細胞表型檢測

取增殖培養基培養的原代、P3、P4代殘耳軟骨細胞，分別進行番紅O、Ⅱ型膠原免疫熒光染色，及Ⅱ型膠原(Type Ⅱ collagen, COLⅡ)、蛋白聚糖(Aggrecan, ACAN)、Ⅰ型膠原 (Type Ⅰ collagen, COL Ⅰ)PCR檢測，引物如下：18S F:5′-TGAGAAA CGGCTACCACATC-3′，R:5′-TCCCAAGATCCAACT ACGAG-3′;COL Ⅱ F:5′-AGGTCACAGAGGTTATCC AG-3′，R:5′-GTCCGTCCTCTTTCACCAG-3′;ACAN F:5′-CGGCGAAGCAGTACACATC-3′，R:5′-TGGTGT GAGGACGTATGGC-3′;COL Ⅰ F:5′-TGGGATGGAG GGAGTTTAC-3′，R:5′-ATGGCTGCACGAGTCACAC-3′。

1.6 耳廓形態支架的制備

依據成人外耳廓CT掃描數據，應用快速成型技術制作外耳廓陽模(圖1A, B, D)，倒制硅膠陰模(圖1C)。取400 mg無紡聚羥基乙酸(Polyglycolic acid, PGA)(組織工程國家工程研究中心)均勻嵌入陰模，以陽模壓制，滴加0.5%聚乳酸(Polylactic acid, PLA)(Sigma公司)二氯甲烷溶液塑型成寬3 cm，長5.5 cm的耳廓支架(圖1E)。

1.7 旋轉式培養裝置的制備

在250 mL離心瓶側壁嫁接15 mL離心管，接口密封，固定于垂直旋轉攪拌儀側翼，調轉速為6r/min(圖1H)。

1.8 細胞-材料復合物的體外培養及組織學檢測

將0414、0.692和 0.785 g 3例小耳患者的殘耳軟骨細胞分別擴增至P4、P3、P3代，以細胞濃度80×106個/mL重懸于1.2%藻酸鹽溶液，各自接種支架后浸入102 mmol/L的CaCl2溶液，37 ℃放置3 min，凝膠形成后(圖1F)放入旋轉培養裝置，加誘導培養基(含10% 胎牛血清，10 ng/mL TGF-β1,0.22 μmol/L維生素C,10-8mol/L地塞米松，1×ITS，100 U/mL青霉素，0.1 mg/mL鏈霉素)動態培養，設為實驗組。其余1例0.925 g殘耳來源細胞擴增至P3代，不使用藻酸鹽凝膠重懸(圖1G)，直接以普通培養基培養作對照，體外培養10周后取材行HE、番紅O、甲苯胺藍和Ⅱ型膠原免疫組化染色。

1.9 掃描電鏡檢測

將實驗組、對照組體外培養24 h的復合物以2.5%戊二醛固定、乙醇梯度脫水、冷凍干燥后行掃描電鏡檢測。

1.10 統計學分析

2 結果

2.1 殘耳軟骨細胞提取率

40例殘耳軟骨組織重1～1.5 g不等，細胞提取率為(3.90±1.27)×106/g。

2.2 殘耳軟骨細胞的增殖能力和增殖倍數

增殖培養基中P1～P4代細胞增殖能力無明顯差別，第5天后顯著高于普通培養基培養的P1代細胞(Plt;0.05)(圖2A)；殘耳軟骨細胞在普通培養基中傳至P4代可擴增(107.36±18.32)倍，增殖培養基中顯著增至(328.4±50.4)倍(Plt;0.05)(圖2B)。

A, B.data model of human ear shape obtained by computer assistont design; C.silicon negative model; D.resin positive model; E.adult human ear-sized and shaped PGA/PLA scaffold; F.polymerization of cell-scaffold complex embedded in alginate gel; G.complex without alginate gel set as control; H.modified rotating culture devicep

圖1細胞材料復合物的體外培養
Fig1Invitrocultureofcell-scaffoldcomplex

2.3 軟骨細胞表型的變化

P0代殘耳軟骨細胞呈多角形，番紅O、Ⅱ型膠原免疫熒光染色均為強陽性(圖3A)，至P3代細胞呈長梭形，陽性著色明顯減弱(圖3B)，至P4代基本消失(圖3C)。COL Ⅱ、ACAN的mRNA表達情況與細胞水平一致，COL Ⅰ表達隨傳代逐漸增強(圖3D)。

2.4 掃描電鏡檢測結果

藻酸鹽凝膠包埋的殘耳軟骨細胞呈球狀，懸浮在支架當中(圖4A, B)；對照組細胞外形長而扁平，黏附在支架上(圖4C, D)。

2.5 復合物體外培養10周檢測結果

實驗組復合物形成耳廓形態的類軟骨組織(圖5A, B)，觸之有彈性，HE染色見軟骨陷窩，有少量未降解的藻酸鹽凝膠(圖5C)，番紅O、甲苯胺藍與Ⅱ型膠原染色均呈陽性(圖5C1～4)。對照組復合物變形，新生組織薄弱(圖5D)，HE染色示體外4周細胞系長且不規則，無陷窩結構，PGA尚未降解，體外10周時有部分壞死細胞(圖5E)。

3 討論

先天性小耳患者殘耳軟骨是構建組織工程耳廓軟骨重要的種子細胞來源。但殘耳軟骨大小不一，提取的細胞量不定，若以構建正常人大小耳廓軟骨為目的，殘耳軟骨細胞需經歷大量體外擴增。因此，明確殘耳軟骨細胞提取率、 增殖效率及其表型隨傳代的變化情況，是應用自體殘耳軟骨細胞進行臨床個體化耳廓再造的重要基礎。

A.growth curve of P1-P4 cells with or without b-FGF during 10 days; B.amplification folds of cells expanded until P4 with or without b-FGF;*Plt;0.05 between chondrocytes cultured with b-FGF and without b-FGF;#Plt;0.05 between P1 with b-FGF and other groups

圖2殘耳軟骨細胞的增殖能力
Fig2Proliferationofhumanremnantearchondrocytes

A.safranin O and Col Ⅱ staining of P0 chondrocytes; B.safranin O and Col Ⅱ staining of P3 chondrocytes; C.safranin O and Col Ⅱ staining of P4 chondrocytes; D.gene expressions of COLⅡ, ACAN, and COLI in P0, P3, and P4 chondrocytes

圖3軟骨細胞表型隨代數的變化
Fig3Chondrocyticphenotypealteringofremnantearchondrocyteswithpassages(×200)

A, B.SEM of experimental group after seeding 24 hrs; C, D.SEM of control group without alginate gel after seeding 24 hrs圖4 掃描電鏡觀察細胞材料復合物Fig 4 SEM pictures of cell-scaffold complex (A, C:×2 000; B, D:×5 000)

A.gross view of neo-tissue in experimental group; B.gross view of neo-tissue in experimental group from up and down; C.HE staining; C1～4.amplifications of HE staining, safranin O staining, toludine Blue staining, and immunohistochemical staining of Col Ⅱ; D.gross view of neo-tissue in control group; E.HE staining at 4 weeks (black arrow: undegraded PGA fibers) and 10 weeksinvitro

圖5體外培養10周大體觀及組織學
Fig5Grossviewandhistologyofneo-tissuesconstructed10weeksinvitro(C:×100;C1～4:×400;E:×200)

本實驗從大量殘耳樣本中首次明確了殘耳軟骨組織的初始細胞提取率。bFGF可刺激間充質干細胞與軟骨細胞的增殖和成熟[4]，本實驗證實應用bFGF可在短期內獲得充足的軟骨細胞量，同時證實細胞擴增至P3代COL Ⅱ和ACAN表達已明顯減弱，COL Ⅰ表達持續增強，說明軟骨細胞已發生去分化。因此, 按取1 g殘耳軟骨計算，細胞擴增到P3或P4代雖可滿足構建正常人大小耳廓軟骨的細胞量，但需進行表型誘導再分化才能形成軟骨組織。文獻表明3D培養可誘導軟骨表型再分化[5-7]。電鏡結果證實藻酸鹽凝膠包埋的軟骨細胞呈球形，而球形結構利于軟骨表型的穩定[8]，此外藻酸鹽凝膠也有助于維持構建物的特定形態[9]。旋轉培養裝置可使構建物在持續動態旋轉的環境中生長，不僅利于軟骨表型再分化，更便于營養物質滲透及代謝交換[10]。

探索耳廓軟骨的體外構建是軟骨組織工程產業化發展的必然需求。構建復雜形態、大體積的軟骨組織對細胞接種和營養滲透提出了更高要求。本實驗結果證實應用單例小耳畸形患者來源的殘耳軟骨細胞，綜合藻酸鹽凝膠、生長因子及旋轉培養條件進行再分化誘導，可在體外構建正常人大小耳廓形態的類軟骨組織。下一步尚需體內實驗進一步證實其穩定性。

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Generation of full-sized and ear-shaped cartilagewith passaged remnant ear chondrocytes from microtia individual

KANG Ning, LIU Xia, CAO Yi-lin, XIAO Ran*

(Research Center of Plastic Surgery Hospital, CAMS amp; PUMC, Beijing 100144, China)

ObjectiveTo test the feasibility ofinvitrogeneration of a full-sized and ear-shaped cartilage with remnant ear chondrocytes derived from individual microtia patient.MethodsThe initial cell yield of remnant ear chondrocytes was analyzed from 40 cases of microtia. Proliferation was tested by MTS and expansion efficiency was calculated. The chondrocytic phenotype altering after continuous passages was characterized by immunofluorence staining and PCR. P3～P4chondrocytes were seeded onto the PGA/PLA scaffold with the shape and full size of adult human ear. The complex was cultured with a redifferentiation system composed of chondrogenic factors, alginate gel, and a rotating culture device.ResultsThe initial cell yield from remnant ear tissue was(3.90±1.27)×106/g. The proliferative ability of remnant ear chondrocytes from P1～P4passages was enhanced by adding bFGF, and the amplification of the cells expanded to P4could reach around(328.4±50.4)folds. However, the COLⅡ and ACAN expressions gradually declined with passages and became negative in P4 chondrocytes whereas COLI expression showed stronger. The neo-cartilage in the experimental group maintained the ear shape well and

formed cartilaginous structure with positive staining of Safranin O, Toludine Blue, and COL Ⅱ, while the control group failed to form cartilage tissue and only showed fibrous structure.ConclusionsA full-sized and ear-shaped cartilage can be engineeredinvitroby the passaged remnant ear chondrocytes derived from individual microtia under a redifferentiation culture system.

microtia; remnant ear chondrocyte; ear-shaped cartilage; tissue engineering

2013-09-26

2013-11-01

國家自然科學基金(31300801)；北京市科技計劃項目(D090800046609003)

*通信作者(correspondingauthor)： xiaoran@pumc.edu.com

1001-6325(2014)05-0583-06

R 318

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