丹皮酚對人黑素瘤A375細胞增殖和凋亡的影響

陶玥 張孟麗 馬鵬程 孫建方 周武慶 包軍

丹皮酚對人黑素瘤A375細胞增殖和凋亡的影響

陶玥 張孟麗 馬鵬程 孫建方 周武慶 包軍

目的探討丹皮酚對體外培養人黑素瘤A375細胞增殖和凋亡的影響及其作用機制。方法CCK8法檢測0.5,1,2,4,8 mmol/L丹皮酚作用24,48和72 h后A375細胞增殖水平。用0、1.25、2.5和5 mmol/L濃度丹皮酚作用24 h后,以Annexin-V/PI法觀察A375細胞凋亡的變化、分別測定caspase 3,caspase 8和caspase 9的活性,并以Western印跡檢測p53,NF-κB及相關蛋白水平的變化。結果與空白對照組比較,0.5,1,2,4,8 mmol/L丹皮酚作用24,48和72 h后均對A375細胞的增殖有抑制作用,且與時間、濃度呈依賴性。1.25、2.5、5 mmol/L丹皮酚在作用24 h時,A375細胞早期凋亡率由對照組的(3.11±0.53)%分別上升至(13.74±1.73)%、(25.95±0.57)%、(46.44±0.81)%,各組與對照組間差異均有統計學意義(P＜0.05或＜0.01)。2.5 mmol/L和5 mmol/L作用組的caspase 3,caspase 8,caspase 9活性升高,且與對照組間比較,差異均有統計學意義(P＜0.05或＜0.01)。p53及Bax的蛋白水平隨藥物濃度的增加而升高,NF-κB、bcl-2、bcl-XL的蛋白水平隨藥物濃度增加而降低。結論丹皮酚對黑素瘤A375細胞具有抑制增殖和誘導凋亡的作用。可通過細胞內和細胞外兩條途徑發揮促凋亡作用,其機制可能與調節p53及NF-κB基因有關。

黑色素瘤,實驗性;丹皮酚;細胞凋亡;細胞增殖

作者單位:210008南京市鼓樓醫院皮膚科(陶玥、包軍);中國醫學科學院北京協和醫學院皮膚病研究所(張孟麗、馬鵬程、孫建方、周武慶)

丹皮酚(paeonol)是從中藥牡丹皮或徐長卿中提取的有效活性成分。已有大量研究表明,丹皮酚可誘導某些腫瘤細胞的凋亡,如肝癌,卵巢癌等[1-2],但對于黑素瘤細胞的促凋亡及其分子機制及其信號傳導途徑尚未見報道。本研究即以體外培養的人黑素瘤A375細胞為實驗對象,通過測定半胱氨酸天冬氨酸酶(caspase)活性和p53、NF-κB等相關蛋白表達水平的變化,初步探討藥物誘導黑素瘤細胞凋亡的途徑和調節機制。

材料與方法

一、材料

丹皮酚購于中國藥品生物檢定所(純度＞99.0%);二甲基亞砜(DMSO)、1%抗生素/抗真菌溶液、Hoechst33258購于美國Sigma公司,胰酶、1640培養基購于德國Gibco公司,胎牛血清購于上海吉泰公司。CCK8試劑盒購于日本同仁化學公司,Annexin-V/PI凋亡檢測試劑盒購于美國BD Pharmingen公司,caspase-Glo? 3/7,8,9檢測試劑盒購于美國Promega公司。bcl-2抗體,bax抗體購于南京凱基生物科技發展有限公司,p53抗體,NFκB-p65抗體,bcl-XL抗體購于美國Santa Cruz公司。

二、方法

1.細胞培養:使用含10%胎牛血清的1640培養基,在37℃、5%CO2的孵箱中培養A375細胞,取對數生長期的細胞用于各項實驗。

2.藥物配制:藥物溶解于DMSO,其終濃度分別為丹皮酚:0.5、1、2、4、8 mmol/L;DMSO 在培養基中的最大終濃度＜0.2%,經預實驗證實對細胞增殖無影響。

3.CCK8檢測細胞增殖抑制率:將對數生長期的A375細胞按1×104/孔分別接種于96孔板,在37℃、5%CO2下孵育24 h,去上清液,每孔加入一定濃度丹皮酚(0.5、1、2、4、8 mmol/L)的 1640 培養基100 μl,每一濃度設3個復孔,對照組直接加含有DMSO的1640培養基100 μl,空白孔只加含有DMSO的培養基,分別培養24、48、72 h后,以1640培養基小心洗滌細胞2次,每孔加入100 μl 1640培養基,再加入10 μl的CCK8溶液,在37℃、5%CO2下孵育2 h,在酶標儀450 nm波長下測量各孔吸光度值,細胞增殖抑制率=[1-(待篩物各濃度平均吸光度值-空白組平均吸光度值)/(對照組平均吸光度值-空白組平均吸光度值)]×100%。

4.丹皮酚對細胞凋亡率的影響[乙硫氰酸熒光素(Annexin V)-FITC/碘化丙錠(PI)雙染法]:收集經 0、1.25、2.5、5 mmol/L 丹皮酚作用 24 h 后的A375細胞,預冷的PBS洗滌兩遍,以1×連接緩沖液將細胞密度調整為1×106/ml,每管加Annexin V-FITC 5 μl、PI 5 μl,輕輕振蕩混勻,室溫避光染色15min,每管加400 μl 1×連接緩沖液,流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

5.caspase活性的測定:選擇對數生長期的A375細胞,1640培養基調制成細胞懸液,以每孔100 μl、1×105/ml的密度接種在不透光的白底96孔培養板,在37℃、5%CO2下孵育24 h,去上清液,每孔加入一定濃度丹皮酚(1.25、2.5、5 mmol/L)的培養基100 μl,每個濃度設3個復孔,對照組直接加培養基,空白孔不加細胞只加培養基,作用24 h后,將10 μl GF-AFC與2 ml細胞活力測定緩沖液混合,每孔中加入20 μl混合液,充分搖勻后37℃避光孵育30min,測定細胞活力。接著每孔加入120 μl caspase-Glo?3/7,caspase-Glo?8或caspase-Glo?9試劑繼續避光孵育30min,以熒光檢測儀讀數,除以細胞活力讀數即為平均每個細胞的caspase活性值。

6.Western印跡檢測p53,NF-κB及相關基因蛋白水平:參照文獻[3],簡述如下:將A375細胞分別與1.25、2.5、5 mmol/L丹皮酚的培養基2 ml作用24 h,提出相同質量的蛋白,進行凝膠電泳后將蛋白電轉印到硝酸纖維膜上,以含5%的脫脂奶粉的TBST緩沖液室溫封閉1 h,一抗(bcl-2抗體,bax抗體,p53抗體,NF-κB-p65抗體,bcl-XL抗體)4℃孵育過夜,繼以二抗室溫孵育1 h,化學發光法檢測反應條帶。對圖像進行分析,以目的蛋白條帶峰面積值占內參照蛋白條帶峰面積值的百分比反映目的蛋白表達的結果。

7.數據處理:用SPSS 17.0統計軟件進行統計分析,每組數據取平均值,結果以±s表示,組間比較用t檢驗,以P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、CCK8檢測細胞增殖抑制率

與空白對照組比較,0.5、1、2、4、8 mmol/L 丹皮酚作用24、48、72 h均對A375細胞有抑制作用,且與時間、濃度呈依賴關系。隨著藥物濃度的增加和作用時間的延長,丹皮酚對A375細胞的生長抑制率逐漸增高(圖1)。除作用24 h的0.5 mmol/L濃度組外,各組與對照組(增殖抑制率為0%)比較,差異有統計學意義(均P＜0.01)。丹皮酚處理A375細胞的24、48、72 h的半數抑制濃度(IC50) 分別約為5.19 mmol/L、1.50 mmol/L、1.09 mmol/L。

圖1 丹皮酚對A375細胞增殖抑制率的影響

二、Annexin V-FITC/PI雙染法檢測細胞凋亡率1.25、2.5、5 mmol/L 丹皮酚在作用 24 h時,A375細胞早期凋亡率由對照組的(3.11±0.53)%分別上升至(13.74±1.73)%,(25.95±0.57)%和(46.44±0.81)%,各組與對照組間差異有統計學意義(均P＜0.05)。圖2為一組具有代表性的A375細胞凋亡率檢測結果。

圖2 丹皮酚對A375細胞凋亡率影響的流式細胞圖

三、caspase活性檢測結果

如表1所示,1.25、2.5、5 mmol/L丹皮酚在作用24 h時,A375細胞的caspase 3,caspase 8和caspase 9活性均有不同程度的升高。其中caspase 3活性升高最為明顯,分別為對照組的118.13%,167.85%和491.05%。2.5 mmol/L和5 mmol/L作用組的caspase 3,caspase 8,caspase 9活性與對照組間,差異有統計學意義(均P＜0.05)。

四、丹皮酚對p53及bax蛋白水平的影響

Western印跡法對1.25、2.5、5 mmol/L丹皮酚作用24 h后A375中的p53和bax進行檢測。應用BandScan4.5圖像分析軟件,以β肌動蛋白的表達灰度值為標準,計算p53和bax的相對量。對照組、1.25、2.5、5 mmol/L組p53表達與β肌動蛋白的灰度比值分別為 0.66、1.10、1.19、1.49。 bax 表達與 β肌動蛋白的灰度比值分別為 0.74、1.10、1.19、1.49。可見,以未處理的A375細胞為對照,p53和bax在丹皮酚作用的黑素瘤細胞中的表達隨藥物濃度的增加而升高,見圖3。

表1 丹皮酚對A375細胞caspase活性的影響(±s,%)

表1 丹皮酚對A375細胞caspase活性的影響(±s,%)

注:n=3。與對照組相比,a:P＜0.05,b:P＜0.01

濃度(mmol/L) caspase 3 caspase 8 caspase 9對照組 100.00±3.19 100.00±3.24 100.00±3.24丹皮酚1.25 118.13±4.02a 97.34±1.00 87.05±6.77 2.5 167.85±1.04b 121.94±3.83a 128.20±0.43b 5 491.05±0.55b 122.43±1.12a190.76±0.60b

五、丹皮酚對NF-κB及bcl-2、bcl-XL蛋白水平的影響

使用Western印跡法對1.25、2.5、5 mmol/L丹皮酚作用24 h后A375中的p65(NF-κB活性亞單位),bcl-2和bcl-XL進行檢測。應用BandScan4.5圖像分析軟件,以β肌動蛋白的表達灰度值為標準,計算p65,bcl-2和bcl-XL的相對量。對照組、1.25、2.5、5 mmol/L組的p65表達與β肌動蛋白的灰度比值分別為 1.26、1.16、1.12、0.56;其 bcl-2 表達與 β 肌動蛋白的灰度比值分別為 0.68、0.74、0.54、0.25;其bcl-XL表達與β肌動蛋白的灰度比值分別為0.57、0.55、0.46、0.23。圖4可見,以未處理A375細胞為對照,p65,bcl-2和bcl-XL在丹皮酚作用的A375細胞中的表達隨藥物濃度的增加而降低。

圖3 丹皮酚對A375細胞p53和bax表達的影響 1:對照組;2:1.25 mmol/L;3:2.5 mmol/L;4:5 mmol/L

圖4 丹皮酚對A375細胞p65,bcl-2和bcl-XL表達的影響1:對照組;2:1.25 mmol/L;3:2.5 mmol/L;4:5 mmol/L

討 論

研究表明,丹皮酚具有廣泛的藥理活性,包括抗炎、解熱鎮痛、抗動脈粥樣硬化、抑制血小板聚集、抗氧化等作用[4]。我們的研究還發現丹皮酚可以抑制黑素細胞黑素的生成[5]。近年來,從天然植物中篩選抗腫瘤成分一直是國內外抗腫瘤藥物研究的熱點,丹皮酚的誘導腫瘤細胞凋亡的作用也越來越引起學者們的注意。本研究結果表明:丹皮酚能抑制皮膚黑素瘤A375細胞的增殖活性,誘導細胞凋亡,且這種作用隨著藥物濃度的升高和作用時間的增加而逐漸增強,具有濃度和時間依賴性。

誘導細胞凋亡主要有caspase依賴途徑和非caspase依賴途徑,而以前者為主[6]。caspase家族被認為是細胞凋亡的中心環節。目前認為至少有3條通路參與凋亡的發生,包括經典的兩條細胞凋亡途徑:細胞外途徑(細胞表面死亡受體途徑)和細胞內途徑(線粒體引發途徑),以及新近引起關注的內質網通路[7]。其中,在細胞外途徑中,細胞膜表面的TNF家族受體(Fas)接受外源性刺激信號后,通過胞質中的蛋白網絡傳至上游的啟動因子caspase 8,激活啟動凋亡程序[8]。在細胞內途徑中,線粒體接受細胞內的死亡信號,如DNA損傷等有害刺激時釋放細胞色素C,細胞色素C可與Apaf-1結合并使之活化,活化的Apaf-1可結合并激活caspase 9,導致內源性細胞凋亡過程的啟動[9]。活化的caspase 8和caspase 9裂解后可激活下游眾多的caspase。下游的蛋白酶級聯反應是外源和內源途徑的共同途徑,主要的效應分子是caspase 3。我們通過對caspase活性測定,檢測3種重要的凋亡相關蛋白激酶caspase 3,caspase 8和caspase 9在丹皮酚作用于A375細胞時的活性變化。結果顯示以1.25、2.5、5 mmol/L的丹皮酚作用A375細胞24 h后,3種蛋白酶的活性均呈濃度依賴性增加,提示丹皮酚可通過細胞內和細胞外兩種途徑誘導A375細胞凋亡。

NF-κB和p53在調控細胞凋亡過程中起重要作用。在腫瘤的發生發展過程中,NF-κB調控一系列與細胞的存活、增殖、侵襲和轉移等相關的基因的轉錄,參與腫瘤的增殖、侵襲和轉移等各個環節,被認為是腫瘤發生的最重要原癌基因之一,抗腫瘤治療的重要靶點[10]。p53則是第一個被確認與DNA損傷引起的凋亡有關的蛋白。活化的p53可以轉錄激活一系列凋亡效應分子,通過細胞內或細胞外途徑誘導凋亡。bcl-2基因家族是細胞凋亡的重要調節者。根據其對細胞凋亡作用的功能特點,可將bcl-2蛋白家族分為兩類:促凋亡蛋白家族如bax、bak、bad、bid、bim 和抗凋亡蛋白家族, 如 bcl-2、bcl-XL、bcl-w、Mcl-1。NF-κB激活后可通過增加抗凋亡蛋白如bcl-2、bcl-XL等基因的編碼轉錄,從而發揮抗凋亡作用[11]。p53也可以直接轉錄激活隸屬于bcl-2家族的基因如促凋亡蛋白bax,進而促進細胞凋亡[12]。

用Western印跡測定丹皮酚作用的A375細胞中 p53、NF-κB 及其下游基因 bax,bcl-2、bcl-XL 的蛋白水平變化,結果示p53及其下游基因bax的蛋白表達隨丹皮酚濃度的增加而增強,而p65(NF-κB的主要活性單位)和其下游基因bcl-2、bcl-XL的蛋白水平則因丹皮酚的作用逐漸降低。可見,丹皮酚通過下調NF-κB和激活p53誘導黑素瘤A375細胞的凋亡。同時,丹皮酚也通過調節bcl-2家族,尤其是降低bcl-2與bax的比值誘導細胞凋亡。

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2013-11-26)

(本文編輯:吳曉初)

Effects of paeonol on the proliferation and apoptosis of A375 human melanoma cells

Tao Yue*,Zhang Mengli,Ma Pengcheng,Sun Jianfang,Zhou Wuqing,Bao Jun.*Department of Dermatology,Nanjing Drum Tower Hospital,Nanjing 210008,China

s:Ma Pengcheng,Email:mpc815@163.com;Sun Jianfang,Email:fangmin5758@aliyun.com

ObjectiveTo study the effect of paeonol on the proliferation and apoptosis of A375 human melanoma cells and its mechanism.MethodsCell counting kit-8(CCK8)was used to evaluate the proliferative activity of A375 cells treated with paeonol of 0.5,1,2,4,8 mmol/L for 24,48 and 72 hours respectively.Subsequently,A375 cells were treated with paeonol of 1.25,2.5 and 5 mmol/L for 24 hours followed by double staining with annexin V and propidium iodide for the detection of cell apoptosis,fluorometric assay for the estimation of caspase 3,caspase 8 and caspase 9 activity,and Western blot for the determination of the levels of p53,nuclear factor-κB proteins and some of their target proteins.The A375 cells receiving no treatment served as the blank control group.Statistical analysis was carried out byttest.ResultsWithin the investigated concentration and time ranges,paeonol significantly inhibited the proliferative activity of A375 cells in a concentration-and timedependent manner.Compared with the blank control group,a significant increase was observed in the early apoptosis rate in A375 cells treated with paeonol of 1.25,2.5 and 5 mmol/L for 24 hours(13.74%±1.73%,25.95%±0.57%and 46.44%±0.81%vs.3.11%±0.53%,P＜0.05 or 0.01),as well as in the activity of caspase 3,8 and 9 in A375 cells treated with paeonol of 2.5 and 5 mmol/L for 24 hours(P＜0.05 or 0.01).After 24-hour treatment,the protein levels of p53 and Bax were elevated,but those of nuclear factor-κB,Bcl-2 and Bcl-XL were decreased in A375 cells with the increase of paeonol concentration.ConclusionsPaeonol can inhibit the proliferation but induce the apoptosis of A375 cells,and the apoptosis-inducing effect may be realized through intrinsic and extrinsic pathways by modulating nuclear factor-κB and p53 genes.

Melanoma,experimental;Paeonol;Apoptosis;Cell proliferation

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2014.06.005

馬鵬程,Email:mpc815@163.com;孫建方,Email:fangmin5758@aliyun.com