RNA干擾下調PLK1基因對惡性黑素瘤細胞侵襲和失巢凋亡的影響

丁克云 徐娟 滿昌峰 范鈺

RNA干擾下調PLK1基因對惡性黑素瘤細胞侵襲和失巢凋亡的影響

丁克云 徐娟 滿昌峰 范鈺

目的探討RNA干擾技術下調PLK1基因對惡性黑素瘤細胞侵襲的影響和可能機制。方法用PLK1小干擾核糖核酸分子(siRNA)轉染人惡性黑素瘤A375細胞后,分別用實時定量PCR和Western印跡法檢測PLK1mRNA和蛋白表達,Transwell方法檢測細胞侵襲能力,以平板集落形成方法了解癌細胞集落形成情況,分別用瓊脂糖凝膠電泳和TUNEL方法檢測癌細胞失巢凋亡情況。結果惡性黑素瘤A375細胞經PLK1 siRNA轉染后,PLK1 mRNA和蛋白表達明顯下調;siRNA轉染組癌細胞生長明顯受到抑制。與空白對照組和脂質體對照組比較,siRNA細胞轉染組侵襲性明顯下降。失巢凋亡檢測發現,瓊脂糖凝膠電泳出現明顯的梯度圖譜。TUNEL結果顯示,PLK1 siRNA可誘導惡性黑素瘤A375細胞凋亡,siRNA細胞轉染組較空白對照組和脂質體對照組凋亡指數明顯升高[3.86%±0.35%(3.125 nmol/L siRNA組),7.35%±0.36%(6.250 nmol/L siRNA組),17.56%±0.38%(12.500 nmol/L siRNA組)比1.15%±0.25%和1.18% ±0.22%),均P＜0.01]。結論PLK1 siRNA可抑制惡性黑素瘤細胞的侵襲,其機制可能與誘導失巢凋亡有關。

黑色素瘤;RNA干擾;基因,PLK1;腫瘤浸潤

作者單位:212002江蘇鎮江,江蘇大學附屬人民醫院腫瘤研究所

PLK1是哺乳類Polo激酶家族的重要成員之一。研究發現,PLK1在有絲分裂指數增高的細胞和組織中如惡性腫瘤中表達增高[1-4]。有學者發現,PLK1在黑素瘤組織和細胞中表達明顯增高[5-6],提示PLK1基因在惡性黑素瘤發生發展中具有重要的作用,但尚不清楚PLK1基因在惡性黑素瘤增殖和侵襲中的內在機制。本研究用RNA干擾(iRNA)技術,針對PLK1設計合成小干擾核糖核酸分子(siRNA)轉染處理人惡性黑素瘤A375細胞,觀察對細胞侵襲和失巢凋亡的影響。

材料與方法

一、材料

人惡性黑素瘤A375細胞產自南京凱基生物科技有限公司,本院組織細胞生物標本庫凍存。PLK1 siRNA序列:正向:5'-GAGGAGGCUGAGGAUCCUG TT-3',反向:5'-CAGGAUCCUCAGCCUCCUCTT-3',目標位點1253-1273,與已知人類基因組序列無重復,由美國羅氏公司合成高純度的21nt寡核苷酸siRNA。PLK1抗體產自美國 Santa Cruz公司。TRIzol、RNase抑制劑、反轉錄酶 SSRTⅡ、Taq 酶、轉染試劑Oligofectamine均產自美國Invitrogen公司。DNA抽提試劑盒產自上海申能博彩公司。

二、方法

1.細胞培養及轉染處理:惡性黑素瘤A375細胞在含10%胎牛血清的RPMI 1640培養液,37℃、5%CO2、飽和濕度環境的條件下連續培養。轉染前1天,將1.0×105對數期生長的細胞接種于24孔培養板,1 ml/孔,培養過夜。次日進行轉染。操作按說明書進行。分為空白對照組、脂質體對照組、siRNA組(10%胎牛血清的RPMI 1640中含已用脂質體包埋PLK1基因siRNA)3個組。

2.PLK1基因檢測:①mRNA水平檢測:用實時定量PCR檢測。用TRIzol抽提細胞總RNA,取總RNA 1 μg,以oligo dT為引物逆轉錄合成cDNA第一鏈,以此cDNA鏈2 μl為模板進行PCR擴增,步驟參照說明書。引物序列:上游:5'-CAAGCTCATC TTGTGCCCACT-3';下游:5'-GAGAAAGGGCTGCC AGGC-3'。FAM 探針:5'-CCGCTTCTCGTCGATGTA GGTCACG-3'-TAMRA。以GAPDH為內參。PCR反應條件為:95℃,預變性3min,95℃、30 s;52℃、45 s;72℃、45 s;35個循環后72℃再延伸7min;②蛋白水平檢測:轉染48 h后,提取各實驗組細胞總蛋白,蛋白定量后,以β肌動蛋白為內參照,進行Western印跡法檢測。

3.集落形成試驗:用集落形成方法檢測。主要步驟如下:①細胞消化、計數、配制成濃度為1×103個/ml的細胞懸液,6孔細胞培養板中每孔加入1 ml細胞懸液(每孔1×103個細胞);②6孔細胞培養板置于37℃、5%CO2培養箱中培養14 d;③棄去培養基,PBS清洗細胞2次后,加入甲醇1 ml/孔,固定15min后,棄去固定液,以流水緩慢沖洗干凈,每孔加入l ml的姬姆薩液染色30min,以流水緩慢洗去染色液,通風櫥中干燥,顯微鏡下觀察計數。

4.體外侵襲試驗:根據文獻[7]方法,用Transwell方法檢測。細胞計數:用棉簽擦去基質膠和上室內的細胞,移去Transwells,倒置,風干,24孔板中加入500 μl含0.1%結晶紫,將小室置于其中,使膜浸沒在培養基中,37℃、30min后取出,PBS清洗,直徑上取4個視野,照相,計數。

5.細胞失巢凋亡檢測:①失巢凋亡模型制備:以鋪有多聚-HEMA的培養皿作為失巢凋亡模型。按照文獻[8]制備該模型。簡述如下,將多聚HEMA溶于無水乙醇,制備成10mg/ml的多聚-HEMA溶液。將培養皿用PBS洗3遍,然后加上2 ml多聚-HEMA溶液包被;②細胞處理:收集轉染48 h的細胞,吹打均勻,制成5×105細胞/ml的單細胞懸液。將2 ml細胞接種于多聚HEMA的培養皿中,放入培養箱中繼續培養。12 h后,收集細胞,分別用瓊脂糖凝膠電泳和TUNEL檢測細胞失巢凋亡;③瓊脂糖凝膠電泳;用DNA抽提試劑盒按照說明書操作提取DNA,無水乙醇沉淀。25℃瓊脂糖凝膠電泳,電壓60 V,1.5 h。用MPIAS-1000多媒體病理圖文分析系統進行吸光度測定;④TUNEL檢測:蓋玻片上細胞用多聚甲醛固定,室溫1 h。用PBS洗滌蓋玻片,然后在破膜固定液(permeabilization solution)冰上孵育2min。蓋玻片上加50 μl TUNEL反應液,37℃孵育1 h。最后,光鏡下觀察。TUNEL陽性(凋亡)細胞呈亮綠色。凋亡指數(%)=凋亡細胞/細胞總數×100%。

結 果

一、siRNA轉染對PLK1 mRNA和蛋白水平影響

用PLK1 siRNA轉染惡性黑素瘤A375細胞后,分別采用定量PCR和Western印跡檢測PLK1基因mRNA和蛋白水平。結果發現,與對照組細胞比較,siRNA組PLK1基因mRNA水平明顯下調,差異有統計學意義(P＜0.01),見表1。Western印跡結果顯示,與空白對照組比較,PLK1蛋白水平明顯下調,見圖1。

二、PLK-1 siRNA轉染對癌細胞集落的影響

下調PLK-1表達后,對錨著不依賴性增殖和癌細胞穿越基質能力的影響。結果顯示,A375細胞在體外半固體培養體系中可以自發地形成集落。而經siRNA轉染的細胞集落生長呈劑量依賴性減少。當siRNA 濃度為 3.125、6.250、12.500 nmol/L 時集落數分別為52±5、36±6、17±5、與空白對照組對照組集落數78±6比較,siRNA組軟瓊脂集落形成數明顯降低(P＜0.05)。

表1 siRNA對惡性黑素瘤A375細胞PLK1 mRNA水平的影響(±s,%)

表1 siRNA對惡性黑素瘤A375細胞PLK1 mRNA水平的影響(±s,%)

注:n=3

組別 24 h 48 h 72 h空白對照組 100±1.5 100±1.3 100±1.2脂質體對照組 100±1.3 100±1.2 100±1.1 siRNA組3.125 nmol/L 61.8±2.1 49.5±1.9 40.8±1.6 6.250 nmol/L 45.6±1.8 35.8±1.5 26.5±1.7 12.500 nmol/L 29.6±1.6 18.1±1.3 8.9±1.2

三、PLK-1 siRNA轉染對癌細胞侵襲的影響

收集轉染48 h的細胞,用Transwell方法檢測癌細胞侵襲情況。結果發現,當siRNA濃度為3.125、6.250、12.500 nmol/L時穿膜細胞數分別為39±5、19±5、9±3,與空白對照組組56±5比較,siRNA組穿過濾膜的細胞數明顯下降(P＜0.01)。

圖1 siRNA對惡性黑素瘤A375細胞PLK1蛋白的抑制(48 h)

圖2 PLK1 siRNA對惡性黑素瘤細胞DNA梯形條帶的影響(48 h) M:標準參照物;1:空白對照組;2:脂質體對照組;3:siRNA 6.25 nmol/L

表2 PLK1 siRNA對惡性黑素瘤A375細胞凋亡指數的影響(±s)

表2 PLK1 siRNA對惡性黑素瘤A375細胞凋亡指數的影響(±s)

注:n=3

組別 凋亡指數(%)空白對照組 1.15±0.25脂質體對照組 1.18±0.22 siRNA轉染組3.125 nmol/L 3.86±0.35 6.250 nmol/L 7.35±0.36 12.500 nmol/L 17.56±0.38

四、siRNA對癌細胞抗失巢凋亡的影響

A375細胞無論是貼壁培養時還是在鋪在多聚HEMA的培養皿上培養均未見明顯的凋亡現象,說明A375細胞具有一定的抗失巢凋亡的特性。將轉染后的癌細胞轉到鋪有多聚HEMA的培養皿上,9 h后收集細胞,分別用瓊脂糖凝膠電泳和TUNEL檢測。瓊脂糖凝膠電泳檢測結果顯示,與空白對照組、脂質體對照組比較,siRNA轉染組明顯增強,空白對照組、脂質體對照組和siRNA組吸光度值分別為(18 620±1 120、17 880±1 250和118 116±2 520。見圖2。為了解PLK1 siRNA對惡性黑素瘤細胞凋亡的影響,我們用TUNEL方法檢測凋亡指數,結果發現,與空白對照組比較,siRNA組凋亡指數明顯增高。見表2。

討 論

正常真核細胞,除成熟血細胞外,大多需黏附于特定的細胞外基質上才能抑制凋亡而存活,稱為錨著依賴性。腫瘤細胞可以錨著不依賴性增殖。軟瓊脂形成集落的多少可反映腫瘤細胞錨著不依賴性的特性,且與其惡性程度呈正相關。癌細胞侵襲能力強,則在軟瓊脂上形成的集落數目多。本研究發現,經PLK1 siRNA處理惡性黑素瘤細胞軟瓊脂集落數目明顯減少;Transwell方法檢測發現,經siRNA處理后的惡性黑素瘤細胞穿膜細胞數減少。說明PLK1 siRNA可抑制惡性黑素瘤細胞的錨著不依賴性增殖和侵襲能力。

癌細胞侵襲是一個復雜的過程,涉及到很多機制。近年來,失巢凋亡抵抗引起人們重視。細胞與細胞外基質脫離黏附接觸或者是接觸不完全后出現的凋亡現象,被稱為失巢凋亡(anoikis)[8-9]。正常上皮細胞或內皮細胞脫離于細胞外基質的聯系時會發生失巢凋亡,而大多數來源于上皮或內皮的腫瘤細胞則喪失了這種特性,尤其是容易發生轉移的惡性腫瘤細胞,可以遷徙到其他部位再次生長。這種存在于某些腫瘤細胞的抗失巢凋亡現象,是腫瘤獲得轉移增殖功能特性的重要原因之一[10]。同樣地,惡性黑素瘤細胞在體內增殖轉移可能是失巢凋亡抵抗的結果[11]。有學者研究發現,某些癌基因參與了一些惡性腫瘤抗失巢凋亡的調控[9-11]。但目前尚不了解PLK1基因與惡性黑素瘤細胞抗失巢凋亡的關系。

研究失巢凋亡現象一般在包被有多聚HEMA的petri-dish培養皿上進行。多聚HEMA是一種陰離子聚合物,具有均勻的非離子特性,鋪在容器的底部可阻止細胞接觸和ECM的沉淀,可阻止細胞貼壁,細胞呈懸浮狀態,從而誘發失巢凋亡。本研究發現,A375細胞無論是貼壁培養時還是在鋪有多聚HEMA的培養皿上培養均未見明顯的凋亡現象,即表現為抗失巢凋亡。本研究將不同濃度的PLK-1 siRNA轉染處理惡性黑素瘤細胞后,轉到包被有多聚HEMA的petri-dish培養皿中培養。于不同時間收集細胞,分別采用瓊脂糖凝膠電泳和TUNEL檢測。瓊脂糖凝膠電泳顯示,基因組DNA凝膠電泳顯現明顯的梯狀圖譜。凋亡指數結果顯示,轉染組細胞凋亡指數明顯增高,且呈濃度依賴性。提示PLK-1 siRNA增強了癌細胞對失巢凋亡的敏感性。

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2013-07-01)

(本文編輯:吳曉初)

Impacts of RNA interference targeting the polo-like kinase-1 gene on the invasion of and anoikis in human malignant melanoma cells

Ding Keyun,Xu Juan,Man Changfeng,Fan Yu.Cancer Institute,Affiliated People's Hospital of Jiangsu University,Zhenjiang 212002,Jiangsu,China

Fan Yu,Email:yuf36@sina.com

ObjectiveTo investigate the effects of down-regulation of polo-like kinase-1(PLK1)gene by RNA interference(RNAi)on the invasion of a human malignant melanoma cell line A375 and their possible mechanisms.MethodsCultured A375 cells were classified into several groups:blank control group receiving no treatment,liposome group transfected with lipofectamine only,and three siRNA groups transfected with three concentrations of a small interference RNA(siRNA)targeting PLK1 respectively.After additional culture,real time quantitative PCR and Western blot analysis were performed to quantify the expressions of PLK1 mRNA and protein in A375 cells respectively,Transwell invasion assay to evaluate the invasive capacity of A375 cells,agarose gel electrophoresis and terminal deoxynucleotidyl-transferase-mediated dUTP-biotin nick end labelling(TUNEL)to detect anoikis in A375 cells.The colony-forming capacity was also evaluated for A375 cells.Statistical analysis was carried out by one-factor analysis of variance.ResultsThere was a significant decrease in PLK1 mRNA and protein expressions as well as in colony-forming units in the siRNA groups compared with the blank control group(allP＜0.05).The invasive capacity of A375 cells was significantly inhibited in the siRNA groups with the number of migrating cells in Transwell assay being 39±5,19±5 and 9±3 in A375 cells transfected with 3.125,6.250 and 12.500 nmol/L siRNAs respectively,compared to 56±5 in the blank control group(allP＜0.05).A characteristic DNA ladder was observed on agarose gel electrophoresis in the siRNA(6.250 nmol/L)group.Compared with the blank control group and liposome group,the three siRNA groups showed increased apoptotic index(3.86%±0.35%(3.125 nmol/L siRNA),7.35%±0.36%(6.250 nmol/L siRNA)and 17.56%±0.38%(12.500 nmol/L siRNA)vs.1.15%±0.25%(blank control group)and 1.18%±0.22%(liposome group),allP＜0.05).ConclusionsPLK1 siRNA can inhibit the invasion of malignant melanoma cells,likely by inducing anoikis in these cells.

Melanoma;RNA interference;Genes,PLK1;Neoplasm invasiveness

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2014.06.012

江蘇省鎮江市社會發展基金(SH2013048)

范鈺,Email:yuf36@sina.com