瘦素調(diào)節(jié)HaCaT細(xì)胞角蛋白17的表達(dá)

張敏 苗葉 薛柯 李承新

瘦素調(diào)節(jié)HaCaT細(xì)胞角蛋白17的表達(dá)

張敏 苗葉 薛柯 李承新

目的探討瘦素對(duì)HaCaT細(xì)胞角蛋白17(K17)表達(dá)的影響。方法體外培養(yǎng)HaCaT細(xì)胞,給予100 ng/ml的瘦素作用24 h,應(yīng)用實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)K17 mRNA表達(dá)水平、Western印跡及免疫熒光染色法檢測(cè)K17蛋白表達(dá)水平變化。結(jié)果與陰性對(duì)照組(1.000 0±0.000 0)相比較,瘦素組(3.086 7±0.186 1)K17 mRNA表達(dá)顯著升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。Western印跡結(jié)果表明,瘦素組K17蛋白較陰性對(duì)照組顯著上調(diào),細(xì)胞免疫熒光染色結(jié)果與RT-PCR、Western印跡結(jié)果相符。與單純使用瘦素組(2.242 7±0.188 7)相比較,STAT3抑制劑組和Erk1/2抑制劑組K17 mRNA分別為0.674 1±0.060 0、0.855 0±0.390 3,Western印跡和細(xì)胞免疫熒光染色顯示,兩個(gè)抑制劑組的K17蛋白較瘦素組均顯著下調(diào),差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。結(jié)論瘦素可以誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞表達(dá)K17,其機(jī)制可能與激活STAT3、Erk1/2信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑有關(guān)。

HaCaT細(xì)胞;瘦素;角蛋白17

作者單位:710032西安,第四軍醫(yī)大學(xué)西京皮膚醫(yī)院

瘦素(leptin)由肥胖基因編碼的非糖基化蛋白類激素,相對(duì)分子質(zhì)量為16 000,主要由白色脂肪分泌,瘦素受體表達(dá)于卵巢、骨骼肌、胃、腦垂體及肝臟等多種組織部位,瘦素與受體結(jié)合后在抑制食欲、能量代謝、神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫功能中發(fā)揮生理功能[1]。近年來有報(bào)道,對(duì)肥胖治療后有助于銀屑病好轉(zhuǎn),提示肥胖與銀屑病相關(guān),而瘦素是參與機(jī)體代謝的脂肪因子[2]。我們前期研究發(fā)現(xiàn),瘦素對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞活性及細(xì)胞周期、細(xì)胞增殖會(huì)產(chǎn)生影響,并能刺激角質(zhì)形成細(xì)胞產(chǎn)生炎癥因子IL-6,IL-8,TNF-α,免疫組化檢測(cè)正常人與銀屑病患者皮損組織瘦素水平,瘦素在銀屑病患者皮損中過度表達(dá),提示瘦素可能參與銀屑病表皮過度增生增殖,但瘦素在銀屑病病理生理過程中的作用尚不明確[3]。角蛋白17作為銀屑病相關(guān)性細(xì)胞角蛋白在正常皮膚中不表達(dá),而在銀屑病患者皮損區(qū)則特異性高表達(dá)[4],其表達(dá)水平與銀屑病過程和嚴(yán)重程度有一定相關(guān)[5-6]。本研究探討瘦素是否對(duì)HaCaT細(xì)胞角蛋白17表達(dá)有調(diào)控作用。

材料與方法

一、材料

HaCaT細(xì)胞株購于美國ATCC公司(本科常規(guī)保存),重組人瘦素購于美國Peprotech公司(300-27),DMEM/F12培養(yǎng)液購于美國Hyclone公司,總RNA提取試劑盒、SuperScriptⅡ反轉(zhuǎn)錄試劑盒購于日本TaKaRa公司,兔抗人K17單克隆抗體購于美國Epitomics公司,兔抗人β肌動(dòng)蛋白單克隆抗體購于美國Sigma公司,BCA試劑盒購于上海碧云天生物技術(shù)公司,HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體、Cy3標(biāo)記山羊抗兔IgG購于康為世紀(jì)生物科技公司,STAT3通路抑制劑Piceatannol、Erk1/2抑制劑PD-98059購于瑞士Enzo公司。

二、方法

1.細(xì)胞培養(yǎng)與處理:HaCaT細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液,分別接種于75 cm2或175 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶,置于37℃、5%CO2孵箱培養(yǎng),貼壁生長(zhǎng)后,換無血清DMEM/F12培養(yǎng)基,饑餓培養(yǎng)24 h使細(xì)胞同步化后,加入100 ng/ml瘦素的DMEM/F12培養(yǎng)基作用HaCaT細(xì)胞,以不加瘦素處理為陰性對(duì)照組。HaCaT細(xì)胞經(jīng)上述處理24 h后檢測(cè)K17 mRNA及蛋白表達(dá)水平。

2.實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)K17 mRNA表達(dá):用Trizol試劑提取培養(yǎng)的2組HaCaT細(xì)胞的總RNA,用反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行cDNA逆轉(zhuǎn)錄,并以此為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)。反應(yīng)條件為:95℃預(yù)變性30 s,95℃5 s,60℃30 s,72℃45 s,循環(huán)次數(shù)40次,最后73℃延伸5min,以β肌動(dòng)蛋白作內(nèi)參照。K17上游引物:5'-ATGGATCCATGACCATGCAGGCCTTGGAGA-3',K17下游引物:5'-AGGAATTCTCACGTCTTCACATC CAGCAGGA-3',β肌動(dòng)蛋白上游引物:5'-CACGAT GGAGGGGCCGGACTCATC-3',β肌動(dòng)蛋白下游引物:5'-TAAAGACCTCTATGCCAACACAGT-3'。

3.Western印跡檢測(cè)K17蛋白表達(dá):收集2組細(xì)胞,提取蛋白并用BCA試劑盒進(jìn)行蛋白定量后,進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳(5%濃縮膠,10%分離膠)。PVDF膜經(jīng)甲醇激活后,選用半干轉(zhuǎn)膜法,經(jīng)固定轉(zhuǎn)膜電壓20 V轉(zhuǎn)膜22min。轉(zhuǎn)膜后,室溫條件下,用TBST稀釋的5%脫脂奶粉封閉2 h,單克隆兔抗人K17抗體(1∶2 000)孵育于4℃過夜,HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體(1∶2 000)37℃孵箱孵育1 h。使用化學(xué)發(fā)光法,經(jīng)膠片顯影檢測(cè)結(jié)果。

4.免疫熒光染色法檢測(cè)K17蛋白表達(dá):HaCaT細(xì)胞以1.0×103密度進(jìn)行細(xì)胞爬片,按上述方法處理后培養(yǎng)24 h;使用4℃冷丙酮固定,再用0.5%的TritonX-100室溫破膜處理10min;PBS漂洗后,加入兔抗人K17單克隆抗體(1∶1 000)置于4℃濕盒過夜;Cy3標(biāo)記羊抗兔IgG熒光抗體(1∶100)避光置于37℃孵箱1 h;DAPI細(xì)胞核染料(1∶1 000)室溫孵育10min;95%緩沖甘油封片;激光共聚焦顯微鏡觀察熒光染色結(jié)果。

5.STAT3抑制劑及ERK1/2抑制劑對(duì)瘦素表達(dá)K17的影響:細(xì)胞處理同1,饑餓培養(yǎng)24 h后,分別加入含100 ng/ml瘦素、Piceatannol+100 ng/ml瘦素、PD-98059+100 ng/ml瘦素的DMEM/F12培養(yǎng)基,分別在培養(yǎng)24 h后用實(shí)時(shí)PCR、Western印跡、免疫熒光染色法檢測(cè)K17 mRNA及蛋白表達(dá)情況。

6.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:所有數(shù)據(jù)用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件分析,各組檢測(cè)數(shù)據(jù)均以±s表示,各組用兩樣本t檢驗(yàn),P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、瘦素對(duì)HaCaT細(xì)胞K17 mRNA及蛋白表達(dá)的影響

HaCaT細(xì)胞經(jīng)100 ng/ml瘦素處理24 h后,與陰性對(duì)照組經(jīng)PBS處理后HaCaT細(xì)胞相比,瘦素組K17 mRNA表達(dá)(3.0867±0.1861)與陰性對(duì)照組(1.0000±0.0000)相比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=19.421,P＜0.01),且蛋白表達(dá)量上調(diào)明顯(圖1),說明瘦素能夠誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞K17 mRNA及蛋白的表達(dá)。

圖1 Western印跡檢測(cè)瘦素作用于HaCaT細(xì)胞誘導(dǎo)K17蛋白表達(dá)結(jié)果

二、瘦素對(duì)HaCaT細(xì)胞表達(dá)K17免疫熒光檢測(cè)

圖2 免疫熒光檢測(cè)瘦素作用于HaCaT細(xì)胞誘導(dǎo)K17蛋白表達(dá)(×400) K17在胞質(zhì)中表達(dá)紅色熒光,藍(lán)色熒光為DAPI復(fù)染細(xì)胞核。2a:陰性對(duì)照組;2b:瘦素組

HaCaT細(xì)胞經(jīng)100 ng/ml瘦素處理24 h行細(xì)胞爬片,經(jīng)過免疫熒光染色,置于激光共聚焦顯微鏡下(×400)觀察熒光強(qiáng)度。紅色為胞質(zhì)中K17蛋白熒光染色,藍(lán)色為細(xì)胞核,與陰性對(duì)照組相比,瘦素處理后的HaCaT細(xì)胞胞質(zhì)中K17蛋白的紅色熒光明顯增強(qiáng)(圖2),說明瘦素可誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞表達(dá)K17,與RT-PCR、Western印跡結(jié)果一致。

三、STAT3抑制劑piceatannol和Erk1/2抑制劑PD-98059對(duì)瘦素刺激HaCaT細(xì)胞K17 mRNA表達(dá)的影響

實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn),抑制劑與瘦素聯(lián)合處理組HaCaT的K17 mRNA表達(dá)較瘦素組顯著下降,說明STAT3抑制劑Piceatannol和 Erk1/2抑制劑 PD-98059可明顯下調(diào)瘦素所誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞K17 mRNA的表達(dá)(表1)。

表1 STAT3抑制劑Piceatannol和Erk1/2抑制劑PD-98059對(duì)瘦素刺激HaCaT K17 mRNA表達(dá)結(jié)果

四、STAT3抑制劑Piceatannol和Erk1/2抑制劑PD-98059對(duì)瘦素刺激HaCaT細(xì)胞 K17蛋白表達(dá)的影響

Western印跡檢測(cè)發(fā)現(xiàn),抑制劑與瘦素聯(lián)合處理組HaCaT細(xì)胞的K17蛋白表達(dá)較瘦素組顯著下降,說明STAT3抑制劑Piceatannol和Erk1/2抑制劑PD-98059可明顯下調(diào)瘦素所誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞K17蛋白的表達(dá)(圖3)。

圖3 Western印跡檢測(cè)STAT3和ERK1/2通路抑制劑下調(diào)K17蛋白表達(dá)結(jié)果 1:陰性對(duì)照組;2:瘦素組;3:Piceatannol+瘦素組;4:PD-98059+瘦素組

五、STAT3抑制劑Piceatannol和Erk1/2抑制劑PD-98059對(duì)瘦素刺激HaCaT細(xì)胞 K17蛋白細(xì)胞免疫熒光的影響

細(xì)胞免疫熒光染色顯示,STAT3通路抑制劑Piceatannol和ERK1/2通路抑制劑PD-98059處理組的K17蛋白的表達(dá)較瘦素組顯著下降,說明STAT3和ERK1/2通路抑制劑能夠下調(diào)瘦素所誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞表達(dá)K17蛋白,與實(shí)時(shí)PCR、Western印跡結(jié)果一致(圖4)。

圖4 免疫熒光檢測(cè)通路抑制劑對(duì)瘦素作用于HaCaT細(xì)胞誘導(dǎo)K17蛋白表達(dá)(×400) 陰性對(duì)照組K17表達(dá)較弱,瘦素處理細(xì)胞后K17表達(dá)明顯增強(qiáng),蛋白表達(dá)顯著高于陰性對(duì)照組。STAT3和ERK1/2通路抑制劑分別預(yù)處理細(xì)胞后加用瘦素刺激,可見K17紅色熒光強(qiáng)度減弱。4a:陰性對(duì)照組;4b:瘦素組;4c:Piceatannol+瘦素組;4d:PD-98059+瘦素組

討 論

Chen等[7]研究了77例銀屑病患者,與對(duì)照組進(jìn)行年齡和性別匹配,發(fā)現(xiàn)銀屑病組的瘦素高于對(duì)照組4.57倍。我們前期統(tǒng)計(jì)99例尋常型銀屑病患者臨床特征發(fā)現(xiàn),超重和肥胖人群罹患銀屑病的風(fēng)險(xiǎn)顯著升高,瘦素水平與BMI指數(shù)、PASI評(píng)分都呈正相關(guān),100 ng/ml瘦素作為最佳作用濃度,可調(diào)控角質(zhì)形成細(xì)胞釋放細(xì)胞因子和趨化因子,提示瘦素可能通過調(diào)控淋巴細(xì)胞和角質(zhì)形成細(xì)胞生物功能參與肥胖銀屑病發(fā)展[3]。有研究顯示,肥胖是罹患銀屑病的高風(fēng)險(xiǎn)因素,瘦素與銀屑病的病情嚴(yán)重程度存在緊密聯(lián)系,提示瘦素可能參與肥胖個(gè)體銀屑病的發(fā)生及發(fā)展[8-9]。

本研究顯示,瘦素可以誘導(dǎo)角質(zhì)形成細(xì)胞高表達(dá)K17。K17被視為銀屑病自身靶抗原,與鏈球菌M6蛋白有著相同的ALEEAN氨基酸序列[10],還含有多個(gè)銀屑病特異性T細(xì)胞表位,因此能夠通過類似于M6蛋白的作用方式活化T細(xì)胞,刺激T細(xì)胞增殖并促進(jìn)其釋放相應(yīng)的細(xì)胞因子,引起一系列的應(yīng)答反應(yīng)參與銀屑病免疫紊亂的維持[11-12]。我們推測(cè)瘦素可能通過上調(diào)角質(zhì)形成細(xì)胞角蛋白K17表達(dá),與T細(xì)胞結(jié)合后,增加T細(xì)胞的活性狀態(tài),參與T細(xì)胞及其活化后分泌的細(xì)胞因子影響表皮增生及凋亡調(diào)控基因的表達(dá)影響KC的增生,形成一個(gè)惡性循環(huán)。有研究證實(shí),瘦素可以通過STAT3通路促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞增殖,從而導(dǎo)致表皮增生[13]。本研究還發(fā)現(xiàn),瘦素可經(jīng)STAT3抑制劑和Erk1/2抑制劑與瘦素聯(lián)合作用后,明顯抑制K17表達(dá)。Miyoshi研究發(fā)現(xiàn)該通路在銀屑病皮損區(qū)域也有異常的表達(dá),應(yīng)用小分子STA-21抑制STAT3的核轉(zhuǎn)位后,可明顯改善銀屑病皮損,說明STAT3可作為銀屑病治療的靶點(diǎn)[14]。

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2013-10-14)

(本文編輯:吳曉初)

Leptin regulates keratin 17 expression in HaCaT human keratinocytes

Zhang Min,Miao Ye,Xue Ke,Li Chengxin.Xijing Hospital,Fourth Military Medical University,Xi'an 710032,China

Li Chengxin,Email:chengxinderm@163.com

ObjectiveTo evaluate the effect of leptin on K17 expression in HaCaT human keratinocytes.MethodsSome cultured HaCaT cells were treated with leptin(100 ng/ml)or remained untreated for 24 hours followed by the quantification of K17 mRNA expression by real-time PCR and detection of K17 protein expression by Western blot and immunofluorescence staining.To investigate the action mechanism of leptin,some cultured HaCaT cells were divided into several groups to be treated with leptin(100 ng/ml)alone,Piceatannol(an inhibitor of the STAT3 pathway)+leptin(100 ng/ml),PD-98059(an inhibitor of the Erk1/2 pathway)+leptin(100 ng/ml),respectively for 24 hours,with the cells receiving no treatment as the negative control.Subsequently,the mRNA and protein expressions of K17 were measured by the above methods.Statistical analysis was done by the two-samplettest.ResultsThe mRNA expression of K17 was significantly higher in HaCaT cells treated with leptin alone than in those remaining untreated(3.086 7±0.186 1 vs.1.000 0±0.000 0,P＜0.01),but significantly downregulated in HaCaT cells treated with Piceatannol+leptin and those with PD-98059+leptin compared with those treated leptin alone(0.674 1±0.060 0 and 0.855 0±0.390 3 vs.2.242 7±0.188 7,bothP＜0.01).The results of Western blot and immunofluorescence staining were in agreement with those of real-time PCR.ConclusionsLeptin can induce K17 expression in HaCaT cells,likely by activating the STAT3 and Erk1/2 signaling pathways.

HaCaT cells;Leptin;Keratin-17

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2014.06.007

李承新,Email:chengxinderm@163.com