不同輸液方案對(duì)兔腸缺血再灌注損傷小腸細(xì)胞凋亡的影響

蔡 舒，畢 春，陳文棟，李 婭，馬 莉*

(昆明醫(yī)科大學(xué) 第一附屬醫(yī)院 1.麻醉科； 2.醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)科, 云南 昆明 650032)

研究論文

不同輸液方案對(duì)兔腸缺血再灌注損傷小腸細(xì)胞凋亡的影響

蔡 舒1，畢 春1，陳文棟1，李 婭2，馬 莉1*

(昆明醫(yī)科大學(xué) 第一附屬醫(yī)院 1.麻醉科； 2.醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)科, 云南 昆明 650032)

目的觀察限制性輸液和開(kāi)放性輸液對(duì)兔腸缺血再灌注損傷小腸細(xì)胞凋亡的影響。方法70只日本大白耳兔隨機(jī)分成3組，對(duì)照組(control，n=10)、腸缺血再灌注損傷(IRI)限制性輸液組(RFG，n=30)、腸IRI開(kāi)放性輸液組(LFG，n=30)，然后于腸IRI后24、48和72 h各處死10只(n=10)，取小腸回盲部用TUNEL法檢測(cè)小腸細(xì)胞凋亡，用qRT-PCR檢測(cè)其凋亡基因Bcl-2和Bax在mRNA水平上的表達(dá)。結(jié)果兔腸缺血再灌注后3個(gè)時(shí)間點(diǎn)RFG小腸細(xì)胞的凋亡數(shù)明顯少于LFG(P<0.01)。Bcl-2的表達(dá)水平RFG明顯高于LFG(P<0.01)，而促凋亡基因Bax的表達(dá)低于LFG(P<0.01)。結(jié)論與開(kāi)放性輸液方案相比，限制性輸液方案能減輕兔腸缺血再灌注損傷，減少小腸細(xì)胞凋亡。

腸缺血再灌注；限制性輸液；開(kāi)放性輸液；小腸細(xì)胞凋亡

圍手術(shù)期液體治療與術(shù)后并發(fā)癥密切相關(guān)，恰當(dāng)?shù)囊后w治療方案不僅需要維持圍手術(shù)期患者生命體征平穩(wěn)以及內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，而且還要有利于術(shù)后的康復(fù)[1- 3]。近年提出的早期限制性液體復(fù)蘇，是容量復(fù)蘇的革命性概念，在創(chuàng)傷休克領(lǐng)域已得到廣泛應(yīng)用[4- 5]。術(shù)中限制輸入液體可明顯減少腹部大手術(shù)患者術(shù)后的輸液量和液體正平衡量，具有降低促炎性細(xì)胞因子、改善機(jī)體免疫功能的作用。因此，限制性輸液方案更適用于圍手術(shù)期尤其是腹部大手術(shù)患者[6- 7]，限制性輸液方案的合理性、科學(xué)性也正基于此。因此，選擇兔腸缺血-再灌注損傷模型，來(lái)研究在術(shù)中行限制/開(kāi)放輸液對(duì)手術(shù)后恢復(fù)的關(guān)鍵時(shí)期兔腸上皮細(xì)胞受損及凋亡的影響，為制定圍手術(shù)期液體治療方案提供確實(shí)可靠的科學(xué)理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

乳酸林格液和羅氏TUNEL細(xì)胞凋亡原位檢測(cè)試劑盒(Roche公司)，Trizol RNA提取試劑盒(Promega公司)，引物合成(上海生工生物技術(shù)公司)，SYBR premix實(shí)時(shí)定量擴(kuò)增試劑(Roche公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)70只日本大白耳兔，雄性，體質(zhì)量2.5～3.5 kg，由昆明醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心提供(合格證號(hào)：KUMM2011001)。

1.3 建立模型

建立兔腸缺血再灌注模型，耳緣靜脈注射3%戊巴比妥鈉基礎(chǔ)麻醉。耳緣靜脈開(kāi)放輸液通道輸注乳酸林格液。腹部正中切口，暴露并分離腸系膜上動(dòng)脈，用夾閉其根部60 min，松開(kāi)血管夾恢復(fù)腸系膜血流再灌注2 h，制成模型。模型成功后回納腸管后分2層關(guān)腹，麻醉清醒后繼續(xù)正常喂養(yǎng)。

1.4 實(shí)驗(yàn)分組

將70只兔隨機(jī)分為3組：1)對(duì)照組(control，n=10)，不做任何處理直接處死，取小腸回盲部10 cm 處2段。2)限制性輸液組(RFG，n=30)：建立模型，麻醉手術(shù)期間輸乳酸林格液6 mL/(kg·h)。于術(shù)后24、48和72 h分別處死10只，同樣取小腸回盲部10 cm處2段。3)開(kāi)放性輸液組(LFG，n=30)：建立模型，麻醉手術(shù)期間輸乳酸林格液14 mL/(kg·h)，其他同RFG。

1.5 TUNEL法檢測(cè)小腸細(xì)胞的凋亡

分別于模型建立好后即術(shù)后的24、48和72 h取得小腸3～5 cm用4%多聚甲醛固定24 h后,進(jìn)行常規(guī)制片，用TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞的凋亡數(shù)，最后在熒光顯微鏡200倍鏡下隨機(jī)選取10個(gè)視野進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.6檢測(cè)小腸黏膜中凋亡相關(guān)基因Bcl-2和Bax在mRNA水平上的表達(dá)

取得另一段小腸通過(guò)刮片法獲得腸黏膜組織，放于液氮中保存[8]。需要時(shí)取30～50 g的組織用液氮研磨成均勻的小顆粒后，用Trizol RNA提取試劑盒提取RNA，再進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，實(shí)時(shí)定量熒光PCR(qRT-PCR)檢測(cè)其Bcl-2和Bax在mRNA水平上的表達(dá)水平據(jù)熔解曲線計(jì)算2-ΔΔ值(表1)。

表1 引物的主要參數(shù)Table 1 Primers used to amplify mRNAs

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)兔基礎(chǔ)情況比較

經(jīng)單因素方差分析，3組兔的體質(zhì)量無(wú)差異。

2.2 術(shù)中不同的輸液方案對(duì)小腸細(xì)胞凋亡的影響

RFG術(shù)后24、48和72 h的細(xì)胞凋亡數(shù)明顯少于LFG(P<0.01)。在RFG術(shù)后3個(gè)時(shí)間點(diǎn)隨著時(shí)間推移細(xì)胞的凋亡數(shù)逐漸減少，但在LFG術(shù)后48 h的細(xì)胞凋亡數(shù)均高于24和72 h這兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)(P<0.05)(表2，圖1)。對(duì)照組(control)的細(xì)胞凋亡數(shù)與RFG術(shù)后72 h的相近，兩組的細(xì)胞凋亡數(shù)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(表2，圖1)。

A.TUNEL-positive intestinal cells in control；B.In RFG, at postoperative 24 hours；C.in LFG, at postoperative 24 hours；D.in RFG, at postoperative 48 hours；E.in LFG, at postoperative 48 hours；F.in RFG, at postoperative 72 hours；G.in LFG, at postoperative72 hours; TUNEL-positive intestinal cells in LFG were more than RFG; restrictive fluid management could reduce intestinal apoptosis after intestinal IRI (green fluorescence labeling of fragmented DNA)

圖1 TUNEL法檢測(cè)各組的細(xì)胞凋亡Fig 1 TUNEL-positive intestinal cells in each group control(×200)

*P<0.05 compared with control；#P<0.05 compared with RFG.

2.3 RT-qPCR檢測(cè)各組Bcl-2和Bax的表達(dá)

RFG術(shù)后48和72 h Bcl-2的表達(dá)明顯高于LFG(P<0.05)。RFG術(shù)后24、48和72 h Bax的表達(dá)明顯低于LFG。(P<0.05)LFG術(shù)后48 h的Bax的表達(dá)均高于24和72 h(P<0.05)(表3,4，圖2)。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)兔腸缺血再灌注損傷(ischemia-reperfusion injury,IRI)中，限制性輸液組(restrictive fluid group,RFG)小腸細(xì)胞的凋亡數(shù)較開(kāi)放性輸液組(liberal fluid group,LFG)少。則限制性輸液在兔腸IRI時(shí)對(duì)小腸起到了一定的保護(hù)作用。腸道對(duì)缺血再灌注損傷比較敏感，可能當(dāng)腸細(xì)胞發(fā)生大量凋亡時(shí)致使腸道的黏膜損傷、腸道屏障遭到破壞。限制性輸液即在確保機(jī)體有效循環(huán)血量和血流動(dòng)力學(xué)基本穩(wěn)定以及重要器官有效灌注與氧合的前提下適當(dāng)限制液體輸入總量，以降低術(shù)后并發(fā)癥和病死率[8- 9]。腸道黏膜屏障由腸黏膜機(jī)械屏障、免疫屏障、化學(xué)屏障和生物屏障組成， 同時(shí)又通過(guò)各自的信號(hào)通路有機(jī)地結(jié)合在一起，共同防御外來(lái)抗原物質(zhì)對(duì)機(jī)體的侵襲。正常情況下，腸道通過(guò)腸黏膜上皮屏障有效地防止細(xì)菌及其毒素越過(guò)腸黏膜屏障。

表3 RT-qPCR檢測(cè)各組Bax的2-ΔΔ值

*P<0.05 compared with control；#P<0.05 compared with RFG.

表4 RT-qPCR檢測(cè)各組Bcl-2的2-ΔΔ值

*P<0.05 compared with control.

圖2 Bax,Bcl-2,GAPDH熔解曲線Fig 2 Melting curve of Bax,Bcl-2,GAPDH

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)：在LFG中術(shù)后48 h細(xì)胞凋亡最多，高于24和72 h這兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)，這一變化趨勢(shì)與促凋亡基因Bax在mRNA上的表達(dá)水平的變化相同。這更加能夠說(shuō)明與RFG相比，開(kāi)放性輸液方案不能對(duì)腸缺血再灌注損傷形成有效的保護(hù)。

有研究表明，絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)該家族參與細(xì)胞增殖、分化和凋亡等一系列生理病理過(guò)程。其中JNK/SAPK、P38 MAPK兩條通路可被(如滲透壓變化、內(nèi)毒素、紫外線、放射線和細(xì)胞因子等)應(yīng)激活化進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝[10]。激活的JNK/SAPK和P38 MAPK途徑可以啟動(dòng)凋亡程序誘發(fā)細(xì)胞凋亡[11- 12]。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果提示：限制性輸液基本保持了體內(nèi)原有的穩(wěn)定的滲透壓水平，更接近正常時(shí)體內(nèi)的循環(huán)總量，從而較少的引起細(xì)胞凋亡是更加適宜的液體治療方案。相反，開(kāi)放性輸液增加了循環(huán)量相當(dāng)于稀釋了體液使得體內(nèi)滲透壓明顯降低，這種明顯滲透壓變化直接或間接可能會(huì)激活JNK/SAPK或P38 MAPK的信號(hào)途徑，從而誘導(dǎo)了細(xì)胞凋亡，而造成腸黏膜屏障的破壞。為了證明這一假設(shè)，這一課題就有了后續(xù)進(jìn)行的可能性，未來(lái)的實(shí)驗(yàn)可以對(duì)小腸細(xì)胞進(jìn)行體外的滲透壓改變的實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步檢測(cè)相關(guān)蛋白，如P38等的表達(dá)變化，深入研究P38 MAPK 信號(hào)傳導(dǎo)通路與Bcl-2、Bax 在細(xì)胞凋亡中的關(guān)系，有助于進(jìn)一步闡明細(xì)胞凋亡的機(jī)制，從而闡明在腸缺血再灌注損傷中限制性輸液的保護(hù)性的機(jī)制，為圍手術(shù)期發(fā)生腸缺血再灌注損傷時(shí)制定更優(yōu)化的輸液方案。

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The effect of different transfusion protocalson intestinal apoptosis in rabbit intestinal ischemia-reperfusion injury

CAI Shu1, BI Chun1, CHEN Wen-dong1, LI Ya2，MA Li1*

(1.Dept. of Anesthesiology；2.Dept. of Laboratory Medicine，the First Affiliated Hospital of KunmingMedical University, Kunming 650032,China)

ObjectiveTo investigate the effect of different transfusion protocals(restrictive fluid and liberal fluid) on intestinal apoptosis in rabbit intestinal ischemia-reperfusion injury (IRI).MethodsSeventy male rabbits were randomly allocated into three groups, normal control group (NCG,n=10), intestinal IRI restrictive fluid group (RFG,n=30), intestinal IRI liberal fluid group (LFG,n=30), 24, 48 and 72 h after intestine IRI separately rabbits were killed (n=10). Intestine was cut to detect intestinal apoptosis by TUNEL and the expression of Bcl-2， Bax by q-RT-PCR were detected.ResultsThe number of intestinal apoptosis after intestinal IRI in restrictive fluid group was significantly lower than that in liberal fluid group(P<0.01). Anti-apoptosis gene Bcl-2 in RFG was higher than that in LFG(P<0.01), while pro-apoptosis gene Bax in RFG was less than LFG(P<0.01).ConclusionsThe effect restrictive fluid on intestine is mild than LFG, which may be potentically explained by apoptosis of much less.

intestinal ischemia-reperfusion injury; restrictive fluid; liberal fluid; intestinal apoptosis

2013- 06- 13

2013- 11- 26

國(guó)家自然科學(xué)基金(81060159)

*通信作者(correspondingauthor)： supermali123@sina.com

1001-6325(2014)08-1032-05

R 614.2

A

新聞點(diǎn)擊

心臟問(wèn)題與癡呆癥初期征兆有關(guān)

據(jù)美國(guó)WebMD醫(yī)學(xué)新聞網(wǎng)(2013-01-28)報(bào)道，最新研究顯示，有心臟問(wèn)題的老年婦女智力改變的風(fēng)險(xiǎn)較大，這可能是某種癡呆癥開(kāi)始的征兆。

所謂血管性失智，是因?yàn)檠毫飨虼竽X的問(wèn)題而造成智力衰退，它與阿爾茨海默病的記憶和功能喪失不同；阿爾茨海默病是大腦中蛋白質(zhì)堆積造成的。

這篇發(fā)表于美國(guó)醫(yī)學(xué)協(xié)會(huì)神經(jīng)學(xué)(JAMA Neurology)期刊的研究，追蹤住在明尼蘇達(dá)州羅契斯特市1 400多位70～80多歲的男女。研究開(kāi)始時(shí)，所有參與者都沒(méi)有記憶喪失或思考困難等問(wèn)題，每15個(gè)月測(cè)試1次大腦功能。

大約4年后，約有350人罹患了某種輕度認(rèn)知功能障礙(MCI)，包括記憶力減退以及無(wú)法做決定、說(shuō)出正確的話或在熟悉的小區(qū)迷路等問(wèn)題。其中有約95人罹患血管性失智相關(guān)的輕度認(rèn)知功能障礙，他們沒(méi)有記憶力喪失，但有做決定、推理、視覺(jué)空間等其他問(wèn)題。

心臟似乎真的會(huì)影響這些類型智力變化的風(fēng)險(xiǎn)，即使研究人員考慮了會(huì)提高癡呆癥風(fēng)險(xiǎn)的其他因素(例如家族史、腦卒中、高血壓、糖尿病、憂郁癥以及運(yùn)動(dòng)等)，有心房顫動(dòng)、冠心病、心臟衰竭等心臟問(wèn)題，還是會(huì)讓沒(méi)有記憶受損的輕度認(rèn)知功能障礙風(fēng)險(xiǎn)增加1倍。

女性的此種關(guān)聯(lián)性很強(qiáng)，有心臟問(wèn)題的婦女智力變化的概率比沒(méi)有心臟問(wèn)題的女性高了3倍，男性的關(guān)聯(lián)性并不顯著。

研究人員認(rèn)為，規(guī)律的運(yùn)動(dòng)和健康的飲食是預(yù)防心臟病的第一步，已被診斷出心臟疾病的人需要定期檢查是否有糖尿病、高血壓以及膽固醇是否得到控制，對(duì)大腦和心臟的健康是非常重要的。