固態發酵筍殼生產飼料菌種混合配比優化研究

王音WANG Yin；沈勇猛SHEN Yong-meng；侯冠華HOU Guan-hua

（①中國檢驗認證集團寧波有限公司，寧波 315000；②浙江工商職業技術學院，寧波 315000）

（①China Certification &Inspection Group Ningbo Co.，Ltd.，Ningbo 315000，China；②Zhejiang Business Technology Institute，Ningbo 315000，China）

0 引言

我國作為世界竹子的分布中心和起源地之一，竹子資源占世界總量的30%[1]。每年3-4月份，我國竹子主產區會出產大量的竹筍。這些竹筍只有一部分用于鮮食，由于竹筍不易保鮮，所以大多數的竹筍通常是被加工成筍干或罐頭。在竹筍的加工過程中，實際可食用的筍肉大概只占整個筍體的30%[2]，不可食用的筍頭和筍殼則成為了加工的廢棄物。以往這些廢棄物只是被簡單丟棄，腐爛霉變之后對環境造成了負面影響，而且極大地浪費了寶貴的生物資源。目前，國內外對筍殼加工廢棄物的再利用有多種開發途徑，主要都是通過微生物發酵的手段，將筍殼用于制備膳食纖維、有機肥和生產動物飼料[3]。利用筍殼生產動物飼料主要是將筍殼處理后接入纖維素分解菌和蛋白質分解菌[4]等，通過微生物的代謝活動，利用筍殼中富含的纖維素和礦物質等微量元素，有效轉化分解抗營養物質，從而達到提高蛋白含量，改善筍殼的適口性的目的，制成的飼料原料養分更高且無毒害作用，從口感上來看也更能被牲畜采食、消化和吸收[5]。不僅有效消除了廢棄筍殼對環境的影響，而且提高了生物資源利用率，有效緩解人畜共糧的矛盾[6]。目前發酵筍殼生產動物飼料的研究者一般只采用2-3 個菌種用于實驗[7]。本研究中使用了霉菌、芽孢桿菌、酵母菌和乳酸菌，探索多菌種發酵的筍殼處理方式，以求達到更好更有效的發酵效果。通過對菌株混合比例、錯時發酵方式等的優化，尋找有效發酵筍殼制備生物飼料的新工藝。

1 材料

1.1 菌種 自行篩選得到的具有纖維素分解能力的霉菌菌株N2 和N8，芽孢桿菌（BX2）、酵母菌（H7）和乳酸菌（G16）均由寧波大學食品微生物研究室保存提供。

1.2 培養基 芽孢桿菌BX2 采用LB 固體培養基：1%蛋白胨，1% NaCl，0.5%酵母浸膏，1.5%瓊脂，加蒸餾水溶解，調節pH 值至7.0，121℃高壓蒸汽滅菌20min。N2 與N8采用PDA 斜面培養基[8]：馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂15-20g，自來水1000mL，自然pH，121℃高壓蒸汽滅菌20min。酵母菌H7 采用麥芽汁瓊脂培養基[9]：將干麥芽磨碎，加入3.5 倍量的65℃溫熱水3.5-4Kg，于58-60℃保溫糖化3-4h，用碘液檢查糖化完全后，將其煮沸，瓊脂10-15%。乳酸菌G16 采用乳酸菌分離培養基[10]：水100ml、牛肉膏1g、蛋白胨1g、酵母膏1g、番茄汁20g、葡萄糖1g、吐溫0.05ml、碳酸鈣1.7g、溴甲酚綠0.01g、瓊脂1-2g。PDA液體培養基[11]：馬鈴薯200g，葡萄糖20g，自來水1000mL，自然pH，121℃高壓蒸汽滅菌20min。固體發酵培養基：筍殼粉90%，麩皮8%，（NH4）2SO42%，含水量65%，自然pH。

2 試驗方法

2.1 菌株兼容性實驗 按照表1 的設計，從五個菌株（N2、N8、BX2、H7 和G16）中每次取三個，呈三角狀點植于PDA 平板上（分組方案見表1），經過4d 培養，觀察各菌株的生長情況以及互相之間的影響。

若相鄰兩菌株均能正常生長，兩個菌落交接處自然融合，則判定為兩菌種能相容；若相鄰兩菌株起初長勢基本相當，后其中一菌落出現生長減慢的情況，菌落交接處略有間隙，則判定為兩菌種部分相容；若兩菌株間存在相當明顯的生長趨勢的差別，其中一菌落被另一菌落包圍且相接處有明顯分割線，則判定為兩菌種不能相容。

2.2 液體種子的制備 按照1.2 分別接種五個備選菌株，28℃培養活化，待觀察發現產生孢子成熟后用無菌生理鹽水將孢子洗下，并稀釋成濃度為107個/mL 的孢子懸液。將5mL 孢子懸液接入裝有70mLPDA 液體培養基的三角瓶中，28℃搖床培養1d。

2.3 菌株接入方式

2.3.1 N2、N8 和BX2 混合比例 將N2、N8 和BX2 的液體種子分別按不同的比例混合，按10%的接種量將混合后的液體種子接入固體發酵培養基中，于恒溫箱中以37℃條件下培養72h。發酵結束后分別測量產物中粗蛋白含量和CMC 酶活，選擇粗蛋白含量和酶活都較高的配比為最佳的菌株配比。

2.3.2 G16 和H7 的錯時接入方式 利用2.3.1 試驗所篩選出來的最佳菌株配比在固體發酵培養基中接入混合液體種子，于恒溫箱中以37℃下培養，然后按照表2 設計的方案，以不同的方式接入G16 和H7 的液體種子，72h 發酵結束。

以未接入G16 和H7 的固體培養基為對照，分別測量發酵產物中粗蛋白含量和CMC 酶活，選擇粗蛋白含量和酶活都較高的接入方式為最佳的錯時接入方式。

表2 G16 和H7 錯時接入方式實驗組

2.4 粗蛋白含量測定

運用凱氏定氮法，測定粗蛋白含量。

2.5 CMC 酶活測定 取1.5ml 0.05 mol/L 醋酸緩沖液配制的1.0%羧甲基纖維素鈉溶液，加入0.2ml 粗酶液，50℃反應20min，用DNS 法測定反應后還原糖（葡萄糖）含量，同時做空白對照扣除本底。酶活定義[12]為上述條件下，1ml 發酵液1min 催化底物生成1μmol 葡萄糖的酶量為一個酶活力單位“U”。

2.6 發酵效果評價 對發酵產品的氣味、色澤和質地進行觀察。由于發酵產物的氣味最能直接反應發酵效果，而色澤和質地也能同時從不同的感官角度評價發酵的成敗，因此設計表3 評價筍殼粉的發酵效果。

3 結果與分析

3.1 兼容性實驗結果

按照表1 的設計將五個菌株分組培養后，通過觀察各菌株的生長情況以及互相之間的影響后，對各菌株之間的兼容性作出評價，評價結果見表4。

通過實驗對比，發現個別菌株兩兩共生時，存在其中一個菌株生長較緩慢，菌落之間相接觸部分較小的情況。而大多數菌株兩兩之間都能夠良好生長，兩個菌落相交處接觸緊密。總體而言，這五個菌株之間都均沒有強的拮抗作用，在一起能共存，呈現出較好的兼容性。因此，五個菌株都可以用于在同一個發酵體系內生長。

3.2 混菌接入方式試驗結果

3.2.1 N2、N8 和BX2 的最佳混合比例 將N2、N8 和BX2 按照不同比例混合，按照10%的接種量接入固體發酵培養基中，于37℃條件下培養72h 后，測量產物中粗蛋白含量和CMC 酶活，測量結果見表5。

表3 感官評分標準

表4 菌株兼容性評價結果

通過對比表5 中粗蛋白的含量和CMC 酶活，可以得到以下結論：N2 和N8 混菌發酵產生了疊加效應，推測是這兩個菌株分別產生不同種類的纖維素分解酶，共同作用的時候產生了功能互補，從而達到了更好的發酵效果。N2，N8 和BX2 以3:2:1 的比例接入固體培養基后共同發酵，三個菌株之間發揮了最佳的協同作用，CMC 酶活達到最高值26.4U/mL，發酵產物中粗蛋白含量最高，為20.33%，比空白組中粗蛋白含量提高了57.8%，是最適合的菌種混合比例。

表5 三菌種混合發酵效果

3.2.2 H7 和G16 的最佳錯時接入方式 將N2、N8 和BX2 按照3:2:1 的比例接入固體發酵培養基，發酵一定時間后按照表2 的設計，以不同方式接入菌種H7 和G16，72h 發酵結束后測量發酵產物中粗蛋白含量和CMC酶活，測量結果見表6。

根據表6 顯示的數據可見，按照實驗組F（將纖維素分解菌N2、N8 和芽孢桿菌BX2 以3:2:1 的比例接入固體培養基發酵24h 后同時接入2%的乳酸菌G16 和2%的酵母菌H7）的設計進行發酵，72h 后得到的發酵效果最佳。發酵產物中粗蛋白含量為24.36%，比對比組A 組的粗蛋白含量提高了19.8%。CMC 酶活提高到30.2U/mL，比A 組提高了14.4%。

3.2.3 發酵效果評價 觀察發酵結束后產品的氣味、色澤和質地，結合表3 的評價方式，感官評價結果見表7。由表7 所示感官表現，產品的感官評價結果分值為8 分。說明按照如上的發酵方法處理筍殼粉，發酵出來的產品作為飼料，其外觀量好，適口性強。

表6 五菌種混合發酵效果

表7 筍殼發酵后感官評價結果

4 結論

通過以上固體發酵實驗證明，當N2，N8 和芽孢桿菌BX2 以3:2:1 的比例接種在固體發酵培養基中發酵24h 后同時接入2%的乳酸菌G16 和2%的酵母菌H7，各菌種之間達到最佳的共生和營養作用，產生了最大量的纖維素分解酶，CMC 酶活達到30.2U/mL，有效提高了固體培養基中粗蛋白的含量，使粗蛋白含量提高到24.36%，且發酵產品的外觀良好，是最佳的混菌配比和接入方式。

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