膀胱尿路上皮癌中巨噬細胞移動抑制因子表達的臨床意義

馮留偉，李鐵強，侯俊清

巨噬細胞移動抑制因子（macrophage migration inhibitory factor，MIF）是一種廣泛表達的細胞因子，其生物學功能多樣，包括先天性與獲得性免疫反應中的促炎作用、抑制糖皮質激素、調節 NK 細胞免疫功能、參與細胞增殖與生存、細胞遷移、DNA損傷和細胞周期調控等[1]；MIF 在急性和慢性炎癥病理過程中也發揮著重要作用，如感染性休克、風濕性關節炎和動脈粥樣硬化等。此外，大量研究證實 MIF 在多種腫瘤中高表達，而與其緊鄰的非癌細胞中 MIF 表達無明顯增加[2]。但 MIF 與膀胱尿路上皮癌之間關系的報道甚少。本研究采用免疫組織化學法和 Western bolt 方法，分析 MIF 在膀胱尿路上皮癌中的表達特征及臨床意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 膀胱癌標本 來源于河南大學淮河醫院2006年泌尿外科手術病例 75 例（隨訪至術后5年），均經組織病理學檢查，確診為膀胱尿路上皮癌，切緣組織中未見癌組織浸潤，術前均未經任何治療。其中包括 50 名男性，25 名女性，年齡范圍 39～84 歲，平均年齡（66.8 ± 5.3）歲。組織離體后立即放置 –86 ℃ 冰箱中低溫保存。

1.1.2 主要試劑 免疫組化 ABC 試劑盒為美國Vector Laboratories 公司產品；兔抗 MIF多克隆抗體為美國 Santa Cruz Biotechnology 公司產品；生物素標記山羊抗兔二抗、二氨基聯苯胺（DAB）顯色劑購自中衫金橋公司；PVDF 為美國 Millipore公司產品；ECL購自康為世紀生物科技有限公司。

1.1.3 主要儀器 Power PACTMHC 型電泳儀及Trans-Blot SD?cell 電轉系統為美國伯樂公司產品；顯微鏡及 TS100 成像系統為日本 Nikon 公司產品。

1.2 方法

1.2.1 免疫組織化學 膀胱尿路上皮癌及癌旁組織經 10% 多聚甲醛固定、石蠟包埋、連續切片，切片厚度 4～5 μm。石蠟切片于 70 ℃ 烤箱烘烤30 min、二甲苯脫蠟 10 min、過梯度酒精（100%、90%、80%、70%），EDTA 法修復，2% 羊血清封閉 20 min。2% BSA 作為稀釋一抗（鼠源性單克隆抗 MIF 抗體，1∶100），4 ℃ 孵育過夜。生物素化二抗（羊抗鼠，1∶200）孵育 1 h。DAB 顯色 5 min、蘇木素復染、梯度酒精脫水、二甲苯透明后中性樹膠封片。同時對照組的一抗用 PBS 代替。

結果判定：MIF 蛋白以細胞漿中出現棕黃色顆粒為陽性細胞。首先根據全部組織中腫瘤細胞染色的陽性細胞所占總細胞的比例進行評分。在低倍視野下，陽性細胞所占比例小于 10% 為 0 分，10%～ 25% 為 1 分，25%～50% 為 2 分，50%～75%為 3 分，大于 75% 為 4 分。再根據免疫染色強度進行第二次評分，陰性為 0 分，弱陽性為 1 分，中度陽性為 2 分，強陽性為 3 分。最后將 2 次得到的評分相乘即為最終所得到的免疫組化評分，滿分為 12 分。

1.2.2 Western blot 選取 TNM I～IV 期膀胱尿路上皮癌及手術切緣組織各 10 對，共 40 例。取200 mg 組織，按比例加入組織蛋白裂解液，冰上勻漿 10 min，于 4 ℃、12000×g 離心 5 min，吸取上清，置于 –80 ℃ 保存。用 BCA 法測定總蛋白濃度，在 15% SDS-PAGE 上電泳，蛋白上樣量為 50 μg。電泳完畢后使用電轉儀將樣品轉印至PVDF 膜。5% 脫脂牛奶室溫封閉 1 h；以鼠源性單克隆抗 MIF 抗體（1∶5000）為一抗，室溫孵育2 h 或 4 ℃ 過夜。1×PBS 洗 3 次，每次 10 min，以山羊抗鼠 HRP-IgG（1∶2500）為二抗，室溫孵育1 h，ECL 顯色后暗室曝光，膠片掃描，圖像處理分析。

1.3 統計學處理

將得到的免疫組化評分進行統計學分析。使用SPSS17.0 分析軟件，各組間的分析采用 t 檢驗，患者預后分析采用 Kaplan-Meier 曲線和 Log-rank檢驗分析，患者生存時間統計標準為手術時間開始到死亡時間或者統計終止時間，以 P ≤ 0.05 為有統計學差異。

2 結果

2.1 Western b1ot 結果

40例膀胱鱗癌中，MIF 陽性表達的百分率為72.5%（29/40），部分 Western blot 結果如圖 1A 所示。在 TNM I、II、III、IV 期膀胱尿路上皮癌中，MIF 高（過）表達的百分率分別為 50%（5/10）、70%（7/10）、80%（8/10）、90%（9/10），即隨著臨床分期的增加，其在膀胱尿路上皮癌組織中高表達比例逐漸增加（圖 1B）。與此相應，手術切緣組織中 MIF 的表達量亦逐漸降低。此外，經統計學分析，TNM I 期 和 IV 期 MIF 陽性表達的差異具有顯著的統計學意義（P < 0.05）。

2.2 免疫組織化學法檢測結果

圖1 Western blot 結果Figure1 Western blot result

圖2 MIF 在膀胱正常上皮（A）、高分化癌（B）和低分化癌（C）中的表達情況Figure2 MIF expression in normal uroepithelial (A), well-differentiated uroepithelial cancer (B), poorly-differentiated uroepithelial cancer (C)

表1 MIF 表達與膀胱尿路上皮癌臨床病理資料的相關性Table1 Relationship between MIF expression and clinicopathological features of uroepithelial cancer in bladder

MIF 在膀胱尿路上皮癌中的陽性表達率是78.6%（59/75），著色主要位于細胞膜，如圖 2 所示。結果表明，MIF在高、中、低分化的膀胱尿路上皮癌中高（過）表達的百分率分別為 42%、52.8%、59.3%。分析 MIF 表達與膀胱尿路上皮癌 TNM分期的相關性，發現 MIF 在 TNM I、II、III、IV 期膀胱尿路上皮癌中高（過）表達的百分率分別為60%、68%、73%、100%，且 MIF 表達與膀胱尿路上皮癌的臨床分期有統計學意義（I 期 + II 期與III 期 + IV 期相比，P < 0.05）。MIF 在淋巴結轉移陽性和陰性的膀胱尿路上皮癌中高（過）表達的百分率分別為 66.7%、36.4%，差異有統計學意義（P < 0.05）。然而，MIF 的表達與膀胱尿路上皮癌浸潤深度、性別、年齡、腫瘤位置、腫瘤大體類型無差異（表 1）。

2.3 Kap1an-Meier 生存分析

應用 Kaplan-Meier 生存分析法分析 MIF 表達與膀胱尿路上皮癌患者生存時間的相關性。圖 3顯示 MIF 高表達的膀胱尿路上皮癌患者生存期顯著縮短（P = 0.0341），表明 MIF 的表達越高預示著患者生存時間越短，預后相對較差；相反，MIF表達較低的患者，其生存時間則較長。此外，Kaplan-Meier 生存分析法分析其他臨床資料與膀胱尿路上皮癌患者的生存關系，表明淋巴結轉移、TNM 分期與膀胱尿路上皮癌患者生存期顯著縮短呈正相關，而年齡、性別、腫瘤位置、腫瘤類型、浸潤深度與膀胱尿路上皮癌患者生存期無關。

圖3 MIF 的表達情況與膀胱尿路上皮癌患者生存期的關系（P = 0.0341）Figure3 Correlation between MIF expression and patients with uroepithelial cancer of bladder (P = 0.0341)

3 討論

惡性腫瘤的形成和發生發展是一個多因素、多步驟的極其復雜的緩慢過程，多數惡性腫瘤患者確診時已發展至中晚期，治療措施及效果有限，是導致惡性腫瘤患者高死亡率的根本原因之一。早期診斷和治療能夠明顯提高惡性腫瘤患者的治愈率，降低死亡率，延長患者生存時間。因此，近年來的研究熱點之一是尋找惡性腫瘤早期診斷的生物標志物，以便早期發現腫瘤、徹底治愈[3]。

MIF 是一個分子量為 12.5 kD 的炎癥因子，在急性和慢性炎癥的發病機制中發揮著重要作用，如感染性休克、風濕性關節炎和動脈粥樣硬化等[4]。除此之外，MIF 在多種癌癥中表達水平明顯升高，包括前列腺癌、乳腺癌、黑色素瘤、結腸癌和膠質瘤等[5]。不僅如此，MIF 的表達水平還與多種腫瘤患者的生存期密切相關，提示 MIF 可能與腫瘤的侵襲和轉移有關[6]。因此，MIF 可能是炎癥反應與腫瘤發生的紐帶，在腫瘤發生發展的過程中發揮著重要作用。利用 MIF 拮抗性抗體或基因沉默技術敲低 MIF 表達可導致細胞增殖減慢，抑制腫瘤生長和血管生成，間接影響腫瘤的生長和發展進程。Piette 等[7]報道，MIF 參與人肺腺癌細胞的侵襲與轉移。Rendon 等[4]和 Ren 等[8]研究報道，MIF 在膠質母細胞瘤和前列腺癌的生長和侵襲中也發揮著重要作用。

本研究通過免疫組織化學法和 Western blot方法驗證了 MIF 在膀胱尿路上皮癌及邊緣組織中的表達規律，結果發現：MIF 在膀胱尿路上皮癌中的陽性表達百分率為 78.6%（59/75），而在正常尿路上皮中均無表達，且與患者臨床分期、淋巴結轉移正相關，與患者生存時間負相關。這表明，MIF可能是膀胱尿路上皮癌變多階段演進過程中的重要變化分子。

膀胱尿路上皮癌惡性程度越高，腫瘤浸潤和轉移能力越強。本研究也表明，隨著膀胱尿路上皮癌惡性程度增加，MIF 在其中的表達量也顯著增加（P< 0.05）。因此，我們推測 MIF 可能是膀胱尿路上皮癌早期診斷和預后判斷的重要生物標志之一。

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