紫草素誘導卵巢癌細胞表達鈣網織蛋白促進DC成熟的研究

李紅英，陳紅霞，汪 蕾

(1.湖北省婦幼保健院，湖北 武漢430070;2.湖北科技學院基礎醫學院，湖北 咸寧437100;3.湖北中醫藥大學檢驗學院，湖北武漢430065)

對已形成的腫瘤而言，腫瘤微環境缺乏有效的抗腫瘤免疫應答［1］。近年研究發現，部分促凋亡的藥物不僅能直接損傷腫瘤細胞，還能誘導腫瘤細胞在膜表面暴露鈣網織蛋白等免疫原性相關分子，促進樹突狀細胞(DC)成熟，從而活化腫瘤抗原特異性T細胞［2］，重建腫瘤微環境中特異性的抗腫瘤免疫。卡鉑是治療卵巢癌的一線用藥，雖然能誘導腫瘤細胞凋亡，但無法誘導免疫原性分子的表達［3］。因此尋找其他能激活腫瘤免疫原性的藥物有助于抗腫瘤免疫。紫草素是傳統中藥提取物，具有誘導凋亡等多種生物學活性［4］。但是能否增強卵巢癌細胞的免疫原性有待研究。本研究通過紫草素誘導卵巢癌細胞凋亡，觀察凋亡癌細胞上調DC表達成熟相關膜分子CD86的作用及其與癌細胞膜表面鈣網織蛋白(CRT)的關系，為臨床上建立化療誘導的卵巢癌免疫治療提供實驗依據。

1 實驗資料

1.1 試劑和細胞系 人卵巢癌HO-8910細胞系由湖北科技學院基礎醫學院凍存。紫草素(S7576，純度≥98%)購自Sigma公司，1640培養基、DMEM培養基和胎牛血清(FCS)購自Gibco公司。人淋巴細胞分離液Ficoll(C1077)購自北京普利萊有限公司。PE標記的抗人CRT流式抗體(83220)購自美國 Abcam公司，FITC標記的抗人 CD1α流式抗體(300104)、PE標記的抗人CD86流式抗體(305406)、rhGMCSF(572902)和rhlL-4(574002)均購自美國Biolegend公司，凋亡檢測試劑盒(AnnexinⅤ-FITC/PI，KGA107)購自南京凱基生物科技發展有限公司。鈣網織蛋白抑制性多肽(CRT inhibitor，3077BP-50)購自美國 Biovision公司。

1.2 儀器 流式細胞儀(BD LSR-Ⅱ，美國BD公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 卵巢癌HO-8910細胞培養以及紫草素處理細胞在37℃含5%CO2的空氣培養箱，卵巢癌HO-8910細胞加入含10%FCS的1640，取處于生長對數期的細胞經胰蛋白酶消化洗滌后以1×109L-1的密度接種于6孔板，每孔加入DMEM完全培養基3 mL。實驗分為不同濃度(1 μmol/L、2.5 μmol/L以及5 μmol/L)紫草素處理組和未加入紫草素的對照組。紫草素用DMSO溶解后用培養基稀釋至終濃度，DMSO的終濃度為0.1%;對照組培養基中含有0.1%DMSO。48 h消化收集細胞以300 g離心5 min，用于后續實驗。

1.3.2 流式細胞術檢測細胞凋亡率 收集1.3.1中各組HO-8910細胞用PBS洗2遍，將細胞以5×108L-1的濃度重懸500 μL 的 Binding Buffer 懸浮細胞，加入 10 μL Annexin VFITC和5 μL Propidium Iodide混勻，室溫下避光反應15 min，隨后應用流式細胞儀檢測細胞凋亡率，Annexin V單陽性細胞占所有細胞的比例即為凋亡率。

1.3.3 流式細胞術檢測細胞膜表面鈣網織蛋白的表達 收集1.3.1中各組HO-8910細胞用 PBS洗2遍，取5×108L-1細胞重懸于200 μL的PBS中，加入20 μL PE標記的鈣網織蛋白抗體，4℃燙避光30 min，PBS洗滌2次，再重懸于500 μL的PBS進行流式細胞儀檢測。

1.3.4 人外周血單個核細胞分離以及樹突狀細胞培養 外周血來自于湖北武漢血液中心的健康自愿獻血者。取經過抗凝處理的外周靜脈血，按以下比例加入各種試劑:每10 mL外周血加入10 mLPBS混勻后輕輕加在10 mL的(Ficoll)分離液上層，在室溫下400 g離心30 min。小心吸取白膜層后加入10 mL的PBS，以200 g離心10 min，棄上清后重復洗滌3次。計數得到單個核細胞在12孔板中用含10%FCS的1640培養液重懸。每孔密度為2×109L-1，培養體系為2 mL，2 h后去除懸浮細胞，加入 rhGM-CSF(100 μg/L)和 rhlL-4(100 μg/L)以及10%FCS的1640培養液。隔天半量換液，補加細胞因子至上述濃度。8 d后收集細胞為人外周血來源DC。

1.3.5 卵巢癌HO-8910細胞與DC的混合培養 將1.3.1中各組HO-8910細胞和1.3.4中得到的DC在24孔板中進行混合培養。HO-8910細胞 (4×105cells/孔)，DC(2×105cells/孔)，培養體系為 500 μL/孔。分別分為(1 μmol/L、2.5 μmol/L以及5 μmol/L)紫草素干預HO-8910細胞+DC組;(1 μmol/L、2.5 μmol/L 以及5 μmol/L)紫草素干預 HO-8910細胞+DC組+鈣網織蛋白抑制性多肽(CRT inhibitor)組、未經紫草素干預HO-8910細胞+DC組(對照組)、未經紫草素干預HO-8910細胞+DC組+CRT inhibitor組、DC組(空白組)以及DC+CRT inhibitor組。24 h后半量換液1次，48 h后收集各組細胞進行DC免疫表型檢測。

1.3.6 流式細胞術檢測DC膜表面CD1α和CD86的表達收集1.3.5中各組混合培養的細胞用PBS洗2遍，取5×108L-1細胞重懸于 200 μL PBS 中，加入10 μL FITC 標記的 CD1α抗體，10 μL PE標記的CD86抗體4℃燙避光孵育30 min后PBS洗滌2次，再重懸于500 μL PBS。隨后上機進行流式細胞檢測，以CD1α單陽性的細胞圈門進行分析，CD1αCD86雙陽性細胞占CD1α單陽性細胞的比例即為DC表達CD86的陽性率。

1.4 統計學處理 應用統計軟件SPSS 13.0進行數據的統計分析，所有實驗數據以均數±標準差(±s)表示，組間均數比較用t檢驗，P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 紫草素誘導卵巢癌HO-8910細胞發生凋亡情況 HO-8910細胞經紫草素作用48 h后，細胞凋亡率與未經紫草素處理的對照組比較有顯著性差異(P＜0.01)，并且細胞凋亡率與紫草素之間存在濃度依賴性。見圖1。

圖1 流式細胞術測定各組HO-8910細胞凋亡率

2.2 紫草素誘導卵巢癌HO-8910細胞膜表面表達鈣網織蛋白 HO-8910細胞經紫草素作用48 h后，細胞膜表面的鈣網織蛋白表達率顯著上調，與未經紫草素處理的對照組比較有顯著性差異(P＜0.01)，并且細胞膜表面鈣網織蛋白的表達率與紫草素之間存在濃度依賴性。見圖2。

圖2 流式細胞術測定各組HO-8910細胞鈣網織蛋白表達率

2.3 卵巢癌HO-8910細胞通過膜鈣網織蛋白促進DC上調CD86表達 從外周血分離培養的 DC，純度在80%以上(CD1α陽性率＞80%)。與HO-8910細胞混合培養的各組DC其CD86陽性率均高于空白組DC(未經過混合培養)(P＜0.01);在混合培養的各組中，與經過紫草素干預的 HO-8910細胞混合培養的DC其CD86陽性率均高于與未經過紫草素干預的HO-8910細胞混合培養的對照組DC(P＜0.01);而且隨著干預HO-8910細胞的紫草素濃度升高，與之混合培養的DC表達CD86陽性率增加。為了進一步探討HO-8910細胞刺激DC上調CD86表達與膜表面CRT的關系，在各組中加入CRT抑制性多肽(CRT inhibitor)。結果顯示CRT inhibitor均顯著抑制了與經過紫草素處理的HO-8910細胞混合培養的DC上調表達CD86(P＜0.01);但是在對照組(與DC混合培養的HO-8910細胞未經過紫草素處理)和空白組(未加入HO-8910細胞)，CRT inhibitor對于DC表面CD86的表達均無影響(P＞0.05)。見圖3。

圖3 流式細胞術測定各組DC細胞膜表面CD86分子表達率

3 討 論

近年研究發現，一些細胞毒性的藥物在誘導癌細胞凋亡的同時促使癌細胞膜表面表達CRT和HSP70等DC所識別的分子，通過與DC表面的配體相互作用，促進DC吞噬并提呈腫瘤抗原，進而刺激機體形成特異性致敏淋巴細胞，有助于重建腫瘤局部的免疫格局［5］。本實驗顯示紫草素誘導卵巢癌細胞凋亡的同時促使其在膜表面上調CRT表達，并且與人外周血來源的DC混合培養后促使DC上調其成熟標志之一膜分子CD86。

CRT是存在于內質網中的鈣結合蛋白，參與蛋白質合成期間的折疊，并且通過綁定Ca2+增加內質網中的Ca2+穩定性［6］。新近研究發現，在凋亡期間CRT轉移到細胞膜表面能為DC以及其他吞噬細胞提供“eat-me”信號。敲除CRT蛋白后，凋亡細胞誘導DC活化等免疫反應亦隨之消失［7］。因此CRT的膜轉位可以加強死亡癌細胞的免疫原性。但是不同的促凋亡藥物誘導細胞免疫原性的差異很大，其機制不明。目前未發現治療卵巢癌的一線用藥鉑類能促使CRT等免疫原性分子上調。因此，配伍使用誘導癌細胞免疫原性死亡的藥物將有助于機體的抗腫瘤免疫。本研究發現中藥紫草的有效化學成分紫草素誘導卵巢癌細胞凋亡率的同時膜表面CRT顯著升高，并且呈濃度依賴性。

DC是體內重要的抗原提呈細胞，是特異性免疫應答的啟動者，DC識別癌細胞并提呈腫瘤抗原對于觸發T細胞依賴的抗腫瘤免疫至關重要。未成熟的DC吞噬抗原后分化為成熟的DC，高表達共刺激分子CD80和CD86，這兩種分子亦是DC成熟的標志之一［8］。CD86的表達要早于CD80，因此本實驗選擇CD86作為一個成熟的早期標志，并且觀察到卵巢癌細胞與DC混合培養后，隨著癌細胞CRT陽性率上升，DC表達CD86陽性率亦上調，在加入CRT抑制性多肽后能顯著抑制上述效應，表明CRT在卵巢癌細胞促使DC成熟的過程中起了顯著作用。但是CRT抑制性多肽并不能完全抑制CD86的表達上調，而且與空白組相比，未發生凋亡的癌細胞亦能促使DC的CD86出現一定程度的上調。說明癌細胞尚存在促使DC成熟的多種機制，有待進一步的研究。

目前針對卵巢癌的化療雖然能直接損傷腫瘤細胞，但不能徹底殺傷腫瘤細胞。清除殘留的癌細胞仍有賴于機體重建有效的特異性抗腫瘤免疫。在本實驗中，發現傳統中藥的提取物紫草素能增強癌細胞的免疫原性，從而為臨床上建立化療誘導的卵巢癌免疫治療提供了實驗依據。

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