美國藥典、中國藥典、英國藥典熱原檢測方法的比較

方菁嶷 梁羽 李新寅

熱原(pyrogen)系指能引起恒溫動物體溫異常升高的致熱物質。它包括細菌性熱原、內源性高分子熱原、內源性低分子熱原及化學熱原等。熱原檢測方法有兩種, 分別是家兔法和內毒素檢測法。家兔法系將一定劑量的供試品, 靜脈注入家兔體內, 在規定時間內, 觀察家兔體溫升高的情況, 以判定供試品中所含熱原的限度是否符合規定的一種方法。內毒素法是通過鱟試劑來檢測或量化由革蘭陰性菌產生的細菌內毒素的方法, 此法雖然簡單、快速但對內毒素以外的熱原不靈敏。因此家兔法是一種重要的不可替代的熱原檢測方法。美國藥典、中國藥典、英國藥典對家兔熱原檢測方法都有詳細闡述, 為了了解三種方法的區別, 作者用這三種方法對同一款產品進行了檢測和評價。

1 試驗材料

試驗樣品：某公司生產的生理鹽水；試驗動物：新西蘭純種大白兔；動物來源：蘇州高新區鎮湖實驗動物科技有限公司 SCXK(蘇)2013-0002；飼料：實驗兔全價顆粒飼料(無錫實驗動物廠)；水：自來水(符合GB 5749-2006衛生標準)；室溫：17～25℃；相對濕度：40%～70%；光照:每天需要12小時光照(全光譜日光燈)；選擇健康未使用過的動物；人員：有相應檢測資質的檢測人員。

2 試驗步驟

2.1 動物選擇

2.1.1 英國藥典：試驗前2 d預測體溫, 自耳緣靜脈注入38.5℃的無熱原生理鹽水, 劑量10 ml/kg；從注射前至少90 min開始每隔30 min測量體溫1次, 直至注射后3 h；體溫變化不超過0.6℃可以用于實驗。

2.1.2 中國藥典：試驗前3 d預測體溫；每隔30 min測量體溫1次, 共測8次；8次體溫均在38.0～39.6℃的范圍內,且單個兔最高與最低體溫相差不超過0.4℃可以用于試驗。

2.1.3 美國藥典：試驗前3 d預測體溫；每隔30 min測量體溫1次, 共測8次；8次體溫均未超過39.8℃可以用于試驗。

2.2 基礎體溫確定

2.2.1 英國藥典：在開始注射前40 min 內, 每隔30 min測量體溫1 次, 共測量2 次, 確定初始溫度的2次測量溫差不超過0.2℃；以此2次體溫的平均值作為該兔的初始體溫；組內動物體溫差異≤1℃, 初始體溫均在38.0～39.8℃之間可繼續試驗。

2.2.2 中國藥典：每隔30 min測量體溫1 次, 測量2 次,2次體溫之差不得超過0.2℃, 以此2次體溫的平均值作為該兔的正常體溫；組內動物體溫差異≤1℃, 體溫均在38.0～39.6℃之間可繼續試驗。

2.2.3 美國藥典：每隔30 min測量體溫1 次, 測量2 次, 以此2次體溫的平均值作為該兔的正常體溫。組內動物體溫差異≤1℃, 體溫均不超過39.8℃, 繼續試驗。

2.3 給藥

2.3.1 英國藥典：在4 min內自耳緣靜脈注入38.5℃的試驗樣品溶液, 劑量10 ml/kg, 從注射前100 min開始每隔30 min測量體溫1次, 直至注射后3 h。

2.3.2 中國藥典：測量正常體溫15 min以內自耳緣靜脈注入規定劑量(10 ml/kg)并溫熱至38℃的試驗樣品, 然后每隔30 min測量其體溫1次。

2.3.3 美國藥典：在10 min內自耳緣靜脈注入溫熱至(37±2)℃的試驗樣品, 劑量10 ml/kg, 然后每隔30 min測量其體溫1次。

2.4 確定體溫升高數

2.4.1 英國藥典：注射后3 h內最高的1次體溫減去初始體溫, 即為該兔體溫的變化數(℃)。

2.4.2 中國藥典：同英國藥典。

2.4.3 美國藥典：同英國藥典。

2.5 判定標準

2.5.1 英國藥典：當試驗兔變化為負值時以0℃計；用3只兔子進行實驗, 必要時加測3只, 總數不超過四批共計12只；對應實驗動物數, 如果體溫上升總和不超過表1第2列,結果可接受；對應實驗動物數, 如果體溫上升總和大于表1第2列, 但小于表1第3列, 按要求加測；對應實驗動物數,如果體溫上升總和大于表1第3列, 該實驗樣品未通過熱原試驗。見表1。

2.5.2 中國藥典：當試驗兔變化為負值時以0℃計；在初試的3只試驗兔中, 體溫升高均低于0.6℃, 并且3只試驗兔

體溫升高總和低于1.3℃, 符合規定, 否則需進行復試；在復試的5只試驗兔中, 體溫升高0.6℃或0.6℃以上的試驗兔不超過1只, 并且初試、復試合并8只試驗兔的體溫升高總和為3.5℃或3.5℃以下, 判試驗樣品的熱原檢查符合規定, 否則不符合規定。

2.5.3 美國藥典：當試驗兔變化為負值時以0℃計；初試的3只試驗兔中, 體溫升高均低于0.5℃；初試時任一動物體溫升高均超過0.5℃, 則選擇5只試驗動物復試, 在試驗的8只兔中, 體溫升高0.5℃或0.5℃以上的試驗兔不超過3只,并且8只試驗兔的體溫升高總和≤3.3℃, 判試驗樣品的熱原檢查符合規定, 否則不符合規定。

3 結果

3.1 英國藥典試驗結果, 見表2。

3.2 中國藥典試驗結果, 見表3。

3.3 美國藥典試驗結果, 見表4。

表1 評價標準

表2 英國藥典試驗結果

表3 中國藥典試驗結果

表4 美國藥典試驗結果

3.4 結果分析

3.4.1 英國藥典：3只試驗兔體溫變化總和超過1.15℃, 需要復測或判為不符合英國藥典要求。

3.4.2 中國藥典：3只試驗兔體溫變化總和<1.3℃, 并且體溫升高均低于0.6℃, 判符合中國藥典要求。

3.4.3 美國藥典：單個試驗兔體溫升高達到0.5℃, 需要復測或判為不符合美國藥典要求。

4 討論

從試驗方法分析, 在動物選擇方面, 英國藥典預測體溫前需注射無熱原生理鹽水, 而中國藥典和美國藥典只需直接測量, 前者共測量10次, 后兩者只需測8次, 明顯英國藥典在動物選擇方面要求高的多；后兩者相比, 中國藥典又要比美國藥典要求高, 因為中國藥典規定了允許的體溫區間38.0～39.6℃, 并且單個兔最高與最低體溫相差不超過0.4℃,而美國藥典僅要求8次體溫均未超過39.8℃即可。在基礎體溫確定方面, 三個方法的要求基本一致；但中國藥典在允許的體溫區間要求方面比美國藥典要高。英國藥典規定的給藥速度快, 供試品的溫度高；美國藥典對供試品溫度的要求相對可操作性強一點, 規定了(37±2)℃的區間, 而且給藥速度也較慢。確定體溫升高數方面三種方法一致。英國藥典的判定標準最復雜, 加測的機會也多, 共計可以檢測到12只兔子, 但沒有規定單個兔子體溫升高的限值；中國藥典和美國藥典都給出了單個兔子體溫升高的限值, 但前者比后者寬松0.1℃, 復測后體溫升高總數限值前者比后者寬松0.2℃；但值得一提的是初始的3只兔子體溫升高總數限值英國藥典要求最高, 要求不超過1.15℃, 中國藥典要求不超過1.3℃, 而美國藥典只規定單個試驗兔的體溫升高上限, 就這一點來說英國藥典要求是最高的。

從結果分析, 發現表1雖然不符合英國藥典的要求, 但符合中國藥典和美國藥典的要求；表2符合中國藥典的要求但不符合美國藥典及英國藥典的要求；表3不符合美國藥典的要求但符合中國藥典的要求。也就是說同一款產品用不同的藥典方法做檢測完全有可能得到不同的結論。

綜上所述, 不同的藥典試驗方法雖大同小異, 但動物入選、給藥方式、判定標準的差異完全有可能導致同一款產品按照不同的藥典方法得出不同的結果, 要根據試驗樣品的來源、使用人群、銷售途徑等謹慎選擇試驗方法。

［1］British Pharmacopoeia Commission Office.BP2007.London: The Stationery Office, 2007 (Appendix XIV D):359.

［2］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(二部).北京: 化學工業出版社, 2010:附錄XI.

［3］The united states Pharmacopeial convention.USP 2003, U.S.A.:United Stated Pharmacopeial Convention, 2003:USP34-NF29.