雷公藤甲素對阿霉素腎病大鼠腎臟乙酰肝素酶表達及蛋白尿的影響

曹英杰，陳曉嵐范亞平，楊紅利

（南通大學(xué)附屬醫(yī)院腎臟內(nèi)科，江蘇 南通 226001）

HSPG是腎小球基底膜的重要組成成分，構(gòu)成腎小球濾過的電荷屏障，其結(jié)構(gòu)的破壞系導(dǎo)致蛋白尿的重要原因。Hpa是一種葡萄糖醛酸內(nèi)切酶，能識別HSPG的側(cè)鏈［1－2］。將側(cè)鏈水解為多個小分子片段，導(dǎo)致腎小球基底膜電荷屏障的破壞。近年來研究表明其表達異常與蛋白尿的發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)系［3－4］。雷公藤的主要有效成分雷公藤甲素（triptolide），具有多種藥理作用，包括免疫抑制、抑制炎性反應(yīng)、抗腫瘤、抗生育等。在各種腎小球疾病中，其可以通過多種有效機制保護及修復(fù)腎小球足細胞［5－6］。本實驗中我們觀察阿霉素腎病大鼠模型腎小球中Hpa和HSPG的表達，及雷公藤甲素治療后表達的改變，探討Hpa在此模型中的病理作用及其可能的致病機制，及雷公藤甲素對其的保護作用，為臨床治療腎臟病提供理論基礎(chǔ)和作用靶點。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

健康清潔級雄性SD大鼠，每只體重200～230g，取自南通大學(xué)實驗動物中心。兔抗鼠Hpa抗體購于Groundwork Biotechnology Diagnosticate公司，羊抗鼠HSPG抗體購于lifespan公司，生物素化羊抗兔和兔抗羊二抗購于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。注射用阿霉素購于浙江海正藥業(yè)股份有限公司（生產(chǎn)批號091002），雷公藤甲素購自南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司。

1.2 動物分組及處理

適應(yīng)性喂養(yǎng)SD大鼠1周后按隨機分組法分為3組，①A組（對照組）；②B組（阿霉素模型組）：大鼠尾靜脈一次性注射阿霉素5mg／kg；③C組（雷公藤甲素治療組）：大鼠尾靜脈一次性注射阿霉素5mg／kg后，次日起給予雷公藤甲素（0.2mg／kg／d）灌胃，連續(xù)治療4周。其中A組及B組均在次日給予同療程等量生理鹽水灌胃。

1.3 觀察指標

1.3.1 大鼠24h尿蛋白定量 兩組大鼠分別在注射阿霉素前（0d）及注射后第7、14、21、28d單獨置代謝籠，收集24h尿液，24h尿蛋白定量測定應(yīng)用雙縮脲比濁法。

1.3.2 大鼠腎組織Hpa及HSPG的表達 4%多聚甲醛固定大鼠腎組織，制3μm石蠟切片，行HE、PAS染色。按試劑盒說明書操作免疫組化，脫蠟水化3μm石蠟切片，熱誘導(dǎo)修復(fù)，3%過氧化氫20min后，20%羊血清室溫孵育30min，分別滴加一抗兔抗鼠Hpa（1∶100）和羊抗鼠HSPG（1∶50）4℃過夜。滴加二抗50μl，濕盒37℃孵育30min，DAB顯色，蘇木素襯染色，樹脂封片。每只大鼠腎組織切片選取隨機5個腎小球高倍視野，陽性為呈棕黃色顆粒狀物質(zhì)沉積，全自動圖像分析系統(tǒng)（Leica公司，Quantiment 570970）掃描分析，計算陽性吸光度值。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

各組數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示，各個組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，各時間點兩兩比較采用t檢驗，相關(guān)性分析采用Pearson分析。數(shù)據(jù)處理采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 模型組及對照組腎臟病理改變

注射阿霉素2周后光鏡下腎小球改變不明顯，電鏡下見上皮細胞足突廣泛融合，提示造模成功，符合腎小球微小病變病理特征（圖1B組）。A組為對照組。

圖1 阿霉素腎病大鼠及對照組大鼠腎臟病理改變

2.2 各組大鼠24h尿蛋白定量的變化

見表1。

表1 各組不同時間點24h尿蛋白定量的變化 mg／24h

A組各時間點24h尿蛋白定量差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。B組第7天24h尿蛋白定量有所增加，但與A、C組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；第14、21及28天時，B組24h尿蛋白定量較同時間點A組及同組前一時間點明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（表1）。C組中第14、21及28天時尿蛋白定量較同時間點A組及同組前一時間點明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；而與B組比明顯下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

2.3 腎組織中Hpa及HSPG的表達

A組各時間點Hpa的表達無明顯差異（P＞0.05）。第14、21及28天時，B組、C組Hpa的表達較同時間點A組及同組前一時間點明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（見表2，圖2，圖4）。而HSPG的表達則明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。C組中第14、21及28天時Hpa的表達較同時間點B組明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；而HSPG的表達則明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（見表3，圖3，圖5）。

表2 各組Hpa免疫組化半定量結(jié)果（吸光度A值）

表3 各組HSPG免疫組化半定量結(jié)果（吸光度A值）

圖2 各組Hpa的表達（吸光度A值）

圖3 各組HSPG的表達（吸光度A值）

圖4 各組不同時間點Hpa的表達（免疫組化，×400）

圖5 各組不同時間點HSPG的表達（免疫組化，×400）

2.4 各組尿蛋白定量與Hpa的表達呈正相關(guān)

各組尿蛋白定量與Hpa的表達呈正相關(guān)（r＝0.768，P＜0.05），Hpa與HSPG的表達成負相關(guān)（r＝－0.691，P＜0.05）

見圖6、圖7。

圖6 尿蛋白定量與Hpa的表達呈正相關(guān)

圖7 Hpa與HSPG的表達成負相關(guān)

3 討論

HSPG是一種位于細胞表面、細胞外基質(zhì)及基底膜的大分子物質(zhì)，主要由足細胞和壁層上皮細胞分泌，作為足細胞、內(nèi)皮細胞和壁層上皮細胞的附著點，其主要作用是為腎小球濾過膜的電荷屏障提供負電荷［7－8］。Hpa于N－乙酰葡萄糖苷和D－葡萄糖醛酸結(jié)合部位切斷HSPG的HS側(cè)鏈，使其逐段分解，導(dǎo)致多種與HS結(jié)合的活性因子釋放，如抗凝血酶Ⅲ、血小板源性生長因子、肝細胞生長因子等，參與多種生理與病理過程。

Triptolide主要用于各種自身免疫性疾病及腎炎的治療，是雷公藤的主要有效成分之一［9－10］，其具有保護足細胞、抗炎、免疫抑制、抗腫瘤等作用［11］。目前有關(guān)雷公藤對足細胞的保護作用研究較多，其可以通過多種機制對腎小球足細胞起保護作用。研究表明triptolide對被動型Heymann腎炎療效顯著，其對足細胞足突融合有抑制作用，促進nephrin和podocin等足細胞裂孔膜關(guān)鍵分子的表達，從而促進裂孔膜蛋白結(jié)構(gòu)的修復(fù)和減輕足細胞病變［12］，有效地減少蛋白尿。

阿霉素大鼠模型是經(jīng)典的微小腎病動物模型，許多臨床和動物實驗研究發(fā)現(xiàn)Hpa表達異?？赡芘c微小病變腎病蛋白尿的發(fā)生有關(guān)。KramerA等研究發(fā)現(xiàn)活性氧族（ROS）及腎素血管緊張素系統(tǒng)（RAS）調(diào)節(jié)阿霉素腎病（AN）大鼠腎小球Hpa的表達［13］。但鮮有對HSPG表達及雷公藤甲素對其的影響研究。本實驗以5mg／kg阿霉素尾靜脈注射造模，動態(tài)觀察了各個時間點尿蛋白變化，并觀察腎臟病理變化以及腎臟組織Hpa與HSPG表達的改變。注射7d后尿蛋白開始增多，24h尿蛋白定量在14d后進行性升高，并與Hpa表達呈正相關(guān)，與HSPG表達呈負相關(guān)。組織學(xué)檢測光鏡下腎小球系膜增生不明顯，病變輕微。電鏡下顯示腎小球足細胞足突廣泛融合，符合腎小球微小病變改變。而在雷公藤甲素治療組中，24h尿蛋白定量及Hpa表達明顯降低，而HSPG的表達升高。提示雷公藤甲素可能通過抑制Hpa而減少HSPG的降解，保護腎小球基底膜的電荷屏障，從而改善蛋白尿。

綜上所述，Hpa表達增加及活性增強在腎小球疾病蛋白尿發(fā)生發(fā)展中具有重要病理作用。雷公藤可以通過抑制Hpa的表達而減少蛋白尿的發(fā)生，可能成為雷公藤治療腎臟病新的靶點。

［1］Szymczak M，Kuzniar J，Klinger M.The role of heparanase in diseases of the glomeruli［J］.Arch Immunol Ther Exp，2010，58（1）：45－56.

［2］van den Hoven MJ，Rops AL，Vlodavsky I，et al.Heparanase in glomerular diseases［J］.Kidney Int，2007，72（5）：543－548.

［3］Nadir Y，Brenner B，F(xiàn)ux L，et a1.Heparanase enhances the generation of activated factor X in the presence of tissue factor and activated factor V II［J］.Haematologica，2010，95（11）：1927－1934.

［4］van den Hoven MJ，Waanders F，Rops AL，et a1.Regulation of glomerular heparanase expression by aldosterone，angiotensin II and reactive oxygen species［J］.Nephrol Dial Transplant，2009，24（9）：2637－2645.

［5］Nishida M，Hamaaoka K.Macriphage phenotype and renal fibrosis in obstructive nephropathy［J］.Exphron Exp Nephrol，2008，110：31－36.

［6］仲崇輝，陳曉嵐，蘇寶鳳，等.雷公藤甲素對TGF－β1刺激的系膜細胞增殖與凋亡的影響及機制探討［J］.中華腎臟病雜志，2012，28（11）：894－899.

［7］Nasser NJ.Heparanase involvement in physiology and diseases［J］.Cell Mol Life Sci，2008，65（11）：1706－1715.

［8］Edovitsky E，Lerner I，Zcharia E，et al.Role of endothelial heparanase in delayed－type hypersensitivity［J］.Blood，2006，107（9）：3609－3616.

［9］陳潮紅，洪亦眉，秦衛(wèi)松，等.雷公藤甲素對血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)足細胞損傷的保護作用及其機制研究［J］.腎臟病與透析腎移植雜志，2010，19（6）：511－513.

［10］Zheng CX，Chen ZH，Zeng CH，et al.Typtolide protectes pedocytes from pummycin aminonucleeside induced injury in vivo and in viro［J］.Kidney Int，2008，74（5）：596－612.

［11］Chen BJ.triptolide，a novel immunusuppressive and antiinnammatory agent purified from a Chinese herb Tripterygium wilfordii Hook F［J］.Leuk Lymphoma，2004，42：253－265.

［12］Chen ZH，Qin ws，Zeng CH，et al.triptolide redues proteinuria in experimental membranous nephropathy and protects against C5b－9－induced podocyte injury in vitro［J］.Kidney Int，2010，11：974－988.

［13］Kramer A，van den Hoven M，Rops A，et al.Induction ofglomerular heparanase expression in rats with adriamycin nephropathy is regulated by reactive oxygen species and the renin－angiotensin system［J］.J Am SocNephrol，2006，17（9）：2513－2520.