桑杏湯對兩種細菌的最低抑菌濃度測定及意義

倪圣，丁建中，黃江榮，李侃

（長江大學醫學院，湖北荊州434023）

桑杏湯出自清代醫家吳瑭所著 《溫病條辨》卷一之上焦篇方，“秋感燥氣，右脈數大，傷手太陰氣分者，桑杏湯主之。”此方輕宣溫燥，涼潤止咳，故能 “清氣分之燥也”。近年來對桑杏湯及其加減方治療呼吸系統疾病隨機對照試驗研究文獻的Meta分析顯示，對1310例肺炎、咳嗽變異性哮喘、咳嗽、支氣管炎等受試者療效良好［1－2］。前期研究證實桑杏湯可促進氣道黏液分泌及增加氣道IgG抗體水平，可能是治療呼吸系統疾病的生物學基礎之一［3］。本實驗采用制備含桑杏湯復方水提取物瓊脂平板法測定其對金黃色葡萄球菌（簡稱金葡菌）和銅綠假單胞菌的最低抑菌濃度（Minimum inhibition concentration，MIC），為解析桑杏湯治療溫燥傷肺機制提供實驗證據。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

恒溫培養箱，溫度（6～65）±1℃（上海醫療器械廠）；細菌標準比濁管（DensiCHEK，BioMerieux.Inc，27704－0969／USA）；M－H 藥 物 敏 感 試 驗 瓊 脂（批 號：20131114， 產 品 編 號：HB6232，青島高科園海濤生物技術有限公司）；微量移液器（2～10μl，100μl，德國）。

1.2 實驗菌種

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，ATCC29213）、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa，ATCC27853）質控菌株由原衛生部臨床檢驗中心（NCCL）提供。

1.3 實驗藥材

桑杏湯源自 《溫病條辨》：桑葉9g，杏仁9g，沙參15g，象貝母12g，香豉6g，梔子皮12g，梨皮12g。中藥材購自湖北清大中藥飲片有限責任公司，經湖北中醫藥大學藥學院鑒定教研室鑒定為合格藥材。

1.4 中藥液制備

取桑杏湯一劑，加3倍水浸泡2h后微火煎至100ml，重復3次，3次煎液過濾混勻并水浴濃縮至200ml，其生藥量為0.360g／L。待藥液冷卻至室溫后3500r／min離心20min，取上清液備用。

1.5 菌液制備

取經BioMerieux專用培養基轉種18h的金葡菌、銅綠假單胞菌用無菌生理鹽水制成懸液，用細菌標準比濁管稀釋至0.5麥氏濁度（1.5×108個／ml），當天使用。

1.6 含中藥MH培養基制備

在多次預試驗后，取MH瓊脂、按表1配制不同濃度（mg／ml）的培養基，用1mol／L NaOH調整pH為7.4，經121℃、15min后備用；瓊脂厚度4mm，常規檢菌試驗合格；對照組用無菌生理鹽水代替藥物。用記號筆在每個含藥培養基底部標記分區以便接種細菌懸液。

表1 桑杏湯水提取物藥物敏感試驗培養基制備 最終生藥濃度：mg／ml

1.7 最低抑菌濃度（MIC）測定

取0.1ml細菌懸液（1×108CFU／ml）于無菌EP管中經無菌生理鹽水稀釋為1×105CFU／ml，于每個培養基的3個分區分別接種2μl，經（36.5±0.5）℃、24h后，證實全部培養基無污染菌生長后，用細菌菌落計數器記數菌落，以完全抑制細菌生長濃度為 MIC，參照同類實驗 MIC判斷標準［5］：＜7.81mg／ml生藥濃度為高度敏感，7.81～250.0mg／ml生藥濃度為中度敏感，＞250.0mg／ml生藥濃度時為不敏感［4］。每個試驗重復3次，取均值。

1.8 細菌菌落鑒定

在確認無雜菌污染基礎上進行革蘭染色；對可疑金葡菌菌落進行血漿凝固酶試驗：在盛有1∶4新鮮兔血漿0.5ml的試管中加入各平板生長24h可疑菌落制備的菌液0.5ml，搖蕩均勻，放入（37±1）℃恒溫箱中培養，每0.5h觀察一次，連續觀察6h，呈現凝塊狀為陽性；同時用金葡菌質控菌株和陰性肉湯作為對照。對銅綠假單胞菌采用革蘭染色與菌落色素進行確認。

2 結果

桑杏湯水提取物對金葡球的MIC為25mg／ml，對綠膿假單胞菌的MIC為200mg／ml。見表1。

表2 桑杏湯水提取物對兩種細菌的MIC值 mg／ml

3 討論

革蘭陽性金葡球在環境和人體體表、體內廣泛存在，上呼吸道感染患者鼻腔帶菌率83%，通過其毒素和侵襲性酶引起肺炎、敗血癥等化膿性感染和醫源性感染的主要細菌之一；革蘭陰性銅綠假單胞菌在皮膚、呼吸道、腸道廣泛存在，在機體抵抗力降低、長期應用激素或抗生素時易導致機會性感染，也是常見的醫源性感染病原菌，故本實驗采用上述兩種病原菌進行MIC實驗。鑒于國內尚無測定中草藥對細菌MIC的統一標準，故本實驗參照同類實驗標準，首次測得桑杏湯水提取物對金葡菌和綠膿假單胞菌的MIC分別25mg／ml和200mg／ml（生藥濃度），表明桑杏湯對革蘭陽性細菌和革蘭陰性細菌具有良好抑菌作用（或中度敏感），且對革蘭陽性菌的抑制作用強于革蘭陰性菌，其機理有待研究。

實驗顯示，當桑杏湯達到實驗預先設計的0.360g／L水煎劑濃度時較為黏稠，采用0.45μm真空抽濾除菌法費時且需大量藥液，又要兼顧根據實驗要求精確制備在每個含15ml培養基中達到實驗規定的中藥生藥濃度瓊脂平板，優點是可在一個平板上同時檢測兩種細菌的MIC，方法簡捷、直觀、結果可靠并易發現污染菌，尤其是上述濃度制備的含藥瓊脂平板雖然具有一定顏色的淺棕色色素，但同時具有良好的透明度而能清晰、有效地進行菌落計數。制備含藥瓊脂平板缺點是費時費力，要考慮到中藥復方水煎提取過程中產生復雜的化學反應，更受到制備MH瓊脂需經高壓滅菌處理等導致抗菌物質活性降低或有效成分被破壞，使其抑菌活性降低并導致MIC值偏高［6］，為進一步研究桑杏湯復方藥物成分的“抗菌清熱”作用機制和物質基礎提供重要基礎。

值得注意的是，在連續5次按照常規程序、將新制成的1×104CFU／ml細菌懸液用無菌微量移液器在每個接種點上接種2μl后，其結果是對照組與最低濃度生藥組培養基上均無細菌菌落生長，但調至1×105CFU／ml、在每個點上接種2μl后生長良好且遞度明顯，故本實驗采用的接種細菌懸液為1×105CFU／ml，此種改良方法對相關實驗具有借鑒作用。

［1］趙勤，汪海飚，高振，等.桑杏湯（散）及其加減方治療呼吸系統疾病療效的系統評價 ［J］.中國實驗方劑學雜志，2011，17（7）：254－258.

［2］王渝，陳妙.桑杏湯加減治療咳嗽變異性哮喘臨床觀察 ［A］.海拉爾：全國中醫內科肺系病第14次學術研討會，2010：123.

［3］丁建中，張六通，龔權，等.桑杏湯對溫燥小鼠氣管纖毛運動與呼吸道液及免疫功能的影響 ［J］.中藥藥理與臨床，2006，22（5）：4－5.

［4］中華人民共和國衛生部醫政司.全國臨床檢驗操作規程 ［M］.3版.南京：東南大學出版社，2006：896－905.

［5］高尚進，毛艷，周漢東，等.11種中草藥對8種常見細菌的體外抑菌試驗 ［J］.川北醫學院學報，2008，23（5）：466－468.

［6］候家玉.中藥藥理學 ［M］.北京：中國中醫藥出版，2002：55.