重組鮭魚降鈣素結腸黏附緩釋微球的制備*

宋益民，范鳴浩，楊 青，張學成

（1.青島科技大學制藥工程系，山東 青島 266042；2.中國海洋大學生命學院，山東 青島 266003）

降鈣素（Calcitonin，CT）是由32個氨基酸組成的一種多肽類激素［1］，由脊椎動物的后腮體和哺乳動物的甲狀腺C細胞分泌，且后腮體來源的降鈣素活性高于甲狀腺C細胞分泌的降鈣素［2］。鮭魚降鈣素通過抑制破骨細胞的活性，減少骨鈣丟失，從而降低血鈣含量［3］，同時有明顯的鎮痛作用。在臨床上可以被廣泛地用于高血鈣癥、Paget氏綜合癥、骨質疏松癥等疾病的預防和治療，并且對急性胰腸炎、胃潰瘍、糖尿病也具有輔助治療的作用。

在不同種屬來源的降鈣素中，以鮭魚降鈣素活性最高，但由于其相對分子質量小，容易被胃腸道內存在的大量多肽及蛋白質水解酶降解，還有胃腸道內的低PH值環境和肝臟的首關效應，導致鮭魚降鈣素口服給藥的生物利用度較低（一般小于10%）［4］。目前臨床應用的鮭魚降鈣素以肌肉內注射為主，但病人用后，存在血藥濃度波動大，依從性差等缺點。而且預防和治療骨質疏松等癥時需要長期、頻繁注射給藥，使用十分不便，極大地限制了其臨床應用。因此，為了解決這些問題，現將其制成每顆50mg的結腸黏附緩釋膠囊，并使其達到12h緩釋效果。結腸定位黏附緩釋微球可以使藥物與結腸黏膜表面直接接觸，從而提高藥物的局部濃度，同時還能增加藥物與結腸的接觸時間，提高藥物的生物利用度，降低毒副作用［5］。

由于在自然生物中僅存在極微量的鮭魚降鈣素，而人工合成的造價又十分昂貴，所以極大地限制了它的廣泛應用。2000年，Blanquet提出了建立以釀酒酵母為載體的多肽類藥物口服給藥體系，該方法所制得的藥物被稱為“biodrug”［6］。張學成實驗室利用酵母表面展示載體pyd1構建了在表面表達鮭魚降鈣素的轉基因酵母（yAGA2-r-sCT），并具有明顯的降血鈣活性［7］。本實驗以重組（酵母）鮭魚降鈣素為原料，通過噴霧干燥法制備重組（酵母）鮭魚降鈣素微球，并以市售的結腸溶空心膠囊為定位載體。以微球的釋藥特性為質量評價指標，通過單因素考察和正交試驗設計優化微球的最佳處方和工藝。

1 材料

鮭魚降鈣素轉基因酵母（yAGA2-r-sCT）由中國海洋大學生命學院遺傳學實驗室提供；鮭魚降鈣素標準品，純度≥97.0%，Sandoz公司產品；阿拉伯膠（Gum arabic powder），天津市博迪化工有限公司；β－環糊精（β-Cyclodextrin），天津市博迪化工有限公司；可溶性淀粉（Tragantine），天津科密歐化學試劑有限公司；明膠（Gelatin），天津科密歐化學試劑有限公司；羥丙基甲基纖維素（HPMC），上海晶純試劑有限公司，批號：16706；卡波姆（Carbomer934P），北京鑫洲科技有限公司；結腸溶空心膠囊，廣東省潮州市強基制藥廠；ELISA試劑盒，Peninsula Laboratories Inc，批號06154，包括降鈣素標準品、分析緩沖液、多肽抗體、96孔酶標板（已包被抗體）、標準稀釋液、辣根過氧化物酶、生物素化多肽、底物（TMB和 H2O2）、終止液（2mol·L－1鹽酸）等。

高速離心噴霧干燥機（01S-5，無錫市富超噴霧干燥機械廠）；智能藥物溶出儀（ZRS-8A，天津大學精密儀器廠）；空氣壓縮機（ZB-0.1/8型，浙江臺州鑫磊工貿有限公司）；雙向磁力加熱攪拌器（79-2，黃驊市亞龍儀器儀表廠）；酶標儀（CLINBIO 128，Australia），系列加樣器（上海精密儀器廠）。

2 方法

2.1 重組鮭魚降鈣素的制備

為了從轉基因酵母微球中獲得重組鮭魚降鈣素蛋白rsCT，將10mg微球溶解到500μL緩沖液當中。緩沖液含50mmol/L Tris-HCl（pH5.6），5mmol/L CaCl2。與1Uenterokinase在21℃下作用24h。酶切產物在5 000×g轉速下離心10min，取上清液，得重組鮭魚降鈣素溶液。

2.2 重組鮭魚降鈣素的測定［7］

樣品采用鮭魚降鈣素酶免分析試劑盒［8］進行定量分析，每孔加入標準品溶液或樣品溶液50μL、抗體25 μL、生物素化的多肽25μL，室溫下溫育過夜；每孔加入分析緩沖液300μL，清洗酶標板5次；每孔加入辣根過氧化物酶100μL，室溫下溫育1h；每孔加入分析緩沖液300μL，清洗酶標板5次；每孔加入TMB溶液100 μL，室溫下溫育1h；每孔加入2mol·L－1鹽酸100 μL，終止反應；20min內在490nm波長處測定光密度，并計算結果。用ELISA法檢測樣品時均扣除了空白溶液樣品本底。

2.3 鮭魚降鈣素標準曲線的制備［7］

取空白溶液0.2mL，分別加入鮭魚降鈣素標準品適量，使其濃度分別為5，10，20，40，80，120，160，200 μg·L－1；按2.2中所述方法，進行分析測定，每一濃度進行5個樣本分析，記錄光密度，以濃度（C）對光密度（OD）做四參數非線性回歸分析，得回歸方程為：OD＝－7.8×10－7C3＋3.1×10－4C2＋6.2×10－3C－0.069 5，r＝0.986 7。

鮭魚降鈣素濃度測定方法的檢測范圍為5～200 μg·L－1，最低檢測濃度為5μg·L－1（見圖1）。

圖1 鮭魚降鈣素標準曲線Fig.1 The standard regressive curve of sCT

2.4 釋放度的測定方法

2.4.1 釋放條件 采用轉籃法，設定轉速為100 r·min－1，溫度為（37±0.5）℃，因為市售結腸溶空心膠囊在胃與小腸中完全不溶，所以只考察載藥膠囊在250mL的人工結腸液（pH＝7.8的磷酸鹽緩沖液PBS）中的釋放［9］。

2.4.2 測定方法 取6粒載藥膠囊，放在轉籃中。控制釋放條件，在12h以內，每間隔2h取樣5mL（同時補充同溫同體積的新鮮介質），立即用濾膜濾過，然后精密量取續濾液1mL稀釋10倍。依次按2.1和2.2中所述方法操作，以標準曲線方程求算對應藥物濃度和累積釋放率。

2.5 工藝設計

壁材→40℃溶解→攪拌5min→加入芯材（表達重組鮭魚降鈣素的酵母）、適量HPMC和CP→二次攪拌10min→噴霧干燥。

2.6 正交試驗設計

以進風溫度（A）、進料速度（B）、霧化壓力（C）為試驗因素，設計L9（33）正交試驗表（見表1），確定最優組合，優化噴霧干燥工藝（出風溫度80～90℃）。

表1 正交試驗因素和水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment

3 結果與討論

3.1 最佳壁材的選擇

選擇阿拉伯膠/明膠、β－環糊精/阿拉伯膠、可溶性淀粉/阿拉伯膠、β－環糊精/明膠4種壁材，按照壁材濃度為15%、芯材比為1∶3、HPMC/CP為4∶1進行噴霧干燥，通過測定各個樣品不同時間點的累積釋藥率，以確定最佳的壁材（見圖2）。

從圖2可以看出，微球的壁材不同，其體外溶出的累積釋放率存在較大差異。阿拉伯膠/明膠、可溶性淀粉/阿拉伯膠、β－環糊精/明膠3種壁材所制微球，其12h累積釋放率低于β－環糊精/阿拉伯膠所制微球。阿拉伯膠/明膠和β－環糊精/明膠作壁材時所得產品的12h累積釋放率低于70%，而可溶性淀粉/阿拉伯膠作壁材時所得產品的12h累積釋放率低于60%。說明β－環糊精/阿拉伯膠對于鮭魚降鈣素的保護作用較強，故實驗以β－環糊精/阿拉伯膠作為壁材。

圖2 不同壁材對藥物釋放的影響Fig.2 Effects of different wall material on durg release

3.2 壁材組分比例對藥物釋放的影響

采用β－環糊精/阿拉伯膠作為壁材，選擇質量比為15∶1、10∶1、5∶1、2∶1，在壁材濃度為15%、芯材比為1∶3、HPMC/CP為4∶1的條件下噴霧干燥，通過測定各樣品不同時間點的累積釋藥率，以確定最佳壁材組分比例（見圖3）。

圖3 壁材組分比例對藥物釋放的影響Fig.3 Effects of the proportion of wall material composition on durg release

從圖3中可以看出，β－環糊精比例越大，微球的12h累積釋放率越高，對鮭魚降鈣素的保護作用越強。當繼續加大β－環糊精的用量時，由于其溶解度較低，需要提高溶液溫度，為了保護鮭魚降鈣素，本實驗溫度控制在40℃以內，所以實驗選擇壁材組分質量比例為15∶1。

3.3 壁材濃度對藥物釋放的影響

采用10%、15%、20%3種不同濃度的β－環糊精/阿拉伯膠作為壁材，在芯材比為1∶3、HPMC/CP為4∶1的條件下進行噴霧干燥，通過測定各個樣品不同時間點的累積釋藥率，以確定最佳的壁材濃度（見圖4）。

圖4 壁材濃度對藥物釋放的影響Fig.4 Effects of the concentration of wall material on durg release

壁材濃度為10%時，作為壁材的β－環糊精/阿拉伯膠用量過少，不足以將囊心物完全包裹，微球釋放過快。當β－環糊精/阿拉伯膠的濃度為20%時，溶液黏度也變大。在噴霧干燥過程中噴頭出現冰凌，由于冰凌與空氣的阻力阻礙了噴頭的轉速，產品黏連為絮狀物，外觀不好，而且微球釋放速度過慢，不符合要求，當濃度再大時由于黏度原因還可能使噴頭轉動不起來。當β－環糊精/阿拉伯膠的用量在15%時所得微球外觀較好，符合12h緩釋要求，而且噴霧過程中噴頭也不會出現冰凌，因此選定壁材濃度為15%。

3.4 壁材和芯材比例對藥物釋放的影響

采用濃度為15%的β－環糊精/阿拉伯膠作為壁材，HPMC/CP（4∶1）為生物黏附劑，在芯材比為1∶1、1∶2、1∶3、1∶4 4種不同的條件下進行噴霧干燥，通過測定各個樣品不同時間點的累積釋藥率，以確定最佳的芯材比（見圖5）。

圖5 芯材比對藥物釋放的影響Fig.5 Effects of core material on durg release

芯材比為1∶1、1∶2時，壁材用量過少，突釋效應明顯，不符合緩釋要求，而芯材比為1∶4時，芯材比例過小，微球釋放速度過于緩慢，2h累積釋放率明顯低于40%。當芯材比為1∶3時，微球外觀較好，符合12h緩釋要求，噴頭在噴霧過程中不產生冰凌，故選擇芯材比為1∶3。

3.5 微球中HPMC/CP的比例對藥物釋放的影響

采用HPMC和CP作為生物黏附劑，在質量比為10∶1，4∶1，2∶1，1∶1，1∶2，其他處方成分用量不變的條件下噴霧干燥，通過測定各個樣品不同時間點的累積釋藥率，確定HPMC/CP的最佳比例（見圖6）。

圖6 微球中HPMC/CP的比例對藥物釋放的影響Fig.6 Effects of the ratio of HPMC to CP on durg release in microspheres

由圖6可見，當HPMC比例增大時，微球釋放速率減慢；而當CP比例增大時，微球釋放速率增快。然而當CP比例超過一半以上時，微球易溶脹形成凝膠狀，所以依據12h緩釋要求，HPMC/CP比例為4∶1時緩釋效果最佳，故選取HPMC/CP為4∶1進行下一步試驗。

3.6 噴霧干燥最佳工藝條件的確定

按照表1因素水平表，通過正交試驗，以微球的累積釋放因子S為主要評價標準，確定最優組合，優化噴霧干燥工藝。正交設計試驗的方案和結果見表2。

累積釋放因子S＝｜Q2－30｜＋｜Q6－70｜＋｜Q12－85｜，Q2、Q6、Q12分別代表2、6、12h時藥物的累積釋放率。S值越低，表明所定的標準（中華人民共和國藥典2005年版二部附錄XD釋放度測定法中緩釋制劑的釋放標準）越接近，因素的水平數越佳［10］。表2結果顯示，因素對釋放影響的順序為：進風溫度＞進料速度＞霧化壓力。綜合評價標準，各因素最優水平組合為：A2B1C3，即：進風溫度160℃，進料速度10mL·min－1，霧化壓力0.5MPa。

3.7 重現性

3批緩釋微球最優處方釋藥曲線（見圖7）。按相似因子f2判斷自制品與參比制劑體外釋放行為的相似程度（f2＝50×lg［［1＋1/nΣ（Rt－Tt）2］－0.5×100］，Tt和Rt分別為受試制劑和參比制劑在t時刻的釋放度）。通過計算得出：3批樣品與參比制劑的f2平均值為75，表明3批樣品之間具有良好的批間釋放度重現性，微球制作處方和工藝較為穩定［5］。

表2 正交設計試驗的方案和結果Table 2 Programs and results of orthogonal experiment

圖7 批緩釋微球優化處方釋藥曲線Fig.7 The release curves of the optimized prescription of three groups of sustained release microspheres

4 結論

（1）在4種壁材中，優選β－環糊精/阿拉伯膠進行噴霧干燥，并且當β－環糊精/阿拉伯膠的組分比例為15∶1，壁材濃度為15%，芯材比為1∶3時微球緩釋效果最好。

（2）HPMC是纖維素的衍生物，CP系丙烯酸與丙烯基蔗糖交聯的高分子聚合物，兩者都具有一定的生物黏附性。CP黏附力較強，且隨介質pH的升高，羧基游離，黏附力增強，因此在結腸pH環境下仍能保持較強的黏附力［11］。但卡波姆干顆粒水化易溶脹形成凝膠，容易從組織脫落，影響其黏附力，而HPMC相對溶脹性較低，因此本實驗將兩者混合使用能達到更好的黏附效果［12］。當HPMC/CP為4∶1時，緩釋作用明顯，與空白酵母膠囊相比，能顯著延長藥物在結腸停留時間，使藥物緩慢釋放。

（3）噴霧干燥試驗因素中，進風溫度對微球體外釋放影響最顯著，其次是進料速度，最后是霧化壓力。以進風溫度160℃、進料速度10mL·min－1、霧化壓力0.5 MPa、出風溫度85～95℃條件下噴霧干燥，所得微球能達到緩釋12h的試驗設計要求。

（4）運用單因素考察和正交試驗確定的微球制備最佳處方和工藝合理可靠，重現性良好，與復乳－液中干燥法制備鮭魚降鈣素微球相比，本法不僅制得的微球具有良好的緩釋效果，還可以直接應用于工業化生產［13］。

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