一株鴨瘟病毒的分離與鑒定

付書林+陳夏冰+錢運國+張大丙+楊文海+何斌+金爾光+童偉文+葉勝強+劉武+陶弼菲+陳潔

摘要：從湖北省武漢市某種鴨場送檢的死亡鴨肝臟中分離到1株病毒，結合流行病學調查，剖檢病理變化特征初步診斷為鴨瘟病毒感染。根據GenBank上公布的鴨瘟病毒UL6基因序列設計一對引物，提取病毒核酸DNA進行PCR擴增，得到大小約為416 bp的目的片段。測序結果表明與GenBank上公布的鴨瘟病毒UL6基因的序列相似性達到99%。鴨胚感染試驗表明，感染的鴨胚在第四天開始死亡，并出現典型的鴨瘟病毒感染癥狀。上述結果表明，該種鴨場種鴨死亡是由鴨瘟病毒所引起的。

關鍵詞：鴨瘟；鴨瘟病毒；分離；鑒定

中圖分類號：S852.65+9.1 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2014）19-4644-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2014.19.036

Isolation and Identification of One Duck Plague Virus Strain

FU Shu-lin1， CHEN Xia-bing1， QIAN Yun-guo2， ZHANG Da-bing3， YANG Wen-hai1， HE Bin1， JIN Er-guang1， TONG Wei-wen1， YE Sheng-qiang1， LIU Wu1， TAO Bi-fei1， CHEN Jie1

（1. Wuhan Institute of Animal Husbandry and Veterinary Science， Wuhan 430208，China； 2.Wuhan Vegetable Research Institute， Wuhan 430208， China； 3. College of Veterinary Medicine， China Agricultural University， Beijing 100083， China）

Abstract： One virus strain was isolated from the liver of the dead ducks in a farm of Wuhan city， Hubei province. Combined with epidemiological investigation and autopsy pathology， it was initially diagnosed as duck plague virus infection. Based on the sequences of plague virus gene in GenBank of UL6 gene， one pair of primers was designed and used to PCR amplification of extracted viral nucleic acids DNA. The PCR products were 416 bp and the similarity was 99% compared with the gene sequence of the Duck Plague Virus UL6 gene published. The duck embryo infection experiment showed that duck embryos began to die in the first four days， with typical symptoms of the duck plague virus infection. It is indicated that the case was the infection of duck plague virus.

Key words： duck plague； duck plague virus； isolation； identification

鴨瘟（Duck plague），又名鴨病毒性腸炎（Duck virusenteritis， DVE），是鴨、鵝和其他雁形目禽類的一種急性、熱性、敗血性傳染病[1]。其特征是流行廣泛，傳播較迅速，發病率和死亡率較高。鴨瘟臨床表現為精神沉郁、高熱稽留、兩腿麻痹、下痢、流淚和部分發病鴨頭頸腫大[2]。該病病原為鴨瘟病毒（Duck plague virus），屬于皰疹病毒科α皰疹病毒亞科，核酸類型為線狀雙股DNA[3]。由于對鴨瘟病毒的分子生物學研究相對滯后，基因的功能研究嚴重滯后，因此目前該病的診斷主要依賴于流行病學、臨床癥狀、病理變化和病毒的分離、鑒定。但是目前國內外學者已經建立了一些分子生物學方法對鴨瘟病毒進行鑒別診斷。陳安莉等[4]建立了二重PCR方法能夠區別新城疫病毒和鴨瘟病毒的感染，張艷芳等[5]建立了二重熒光定量RT-PCR方法區分鴨黃病毒和鴨瘟病毒的感染。

本研究根據GenBank上公布的鴨瘟病毒UL6基因序列設計一對PCR引物，成功擴增出目的基因，并通過鴨胚感染試驗證實了鴨瘟病毒在臨床上的感染。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗用9～10日齡櫻桃谷鴨胚由武漢市畜牧獸醫科學研究所自行孵化；病毒基因組DNA提取試劑盒為OMEGA公司產品；DL Marker 2000、Taq酶均為寶生物工程（大連）有限公司產品。

1.2 方法

1.2.1 病料收集與處理 送檢病料來自湖北省武漢市某種鴨場40周齡櫻桃谷種鴨。采集病鴨的肝臟組織搗碎，并按照質量體積比1∶5的比例加入無菌的PBS液混勻進行組織勻漿，然后以4 000 r/min離心10 min，取上清液并用無菌PBS液稀釋作為接種鴨胚的材料。

1.2.2 病毒DNA提取 取送檢死亡的病鴨肝臟，加入無菌的PBS液進行組織勻漿，以4 000 r/min離心10 min，取上清液，然后按照病毒基因組DNA提取試劑盒的說明書進行操作。

1.2.3 引物設計與合成 根據GenBank上公布的鴨瘟病毒UL6基因序列設計一對PCR引物，引物由寶生物工程（大連）有限公司合成。上游引物P1：5′-GAGCGTATTTAGATGAAACTGC-3′，下游引物P2：5′-TGTTGTGATTGTTCC-3′。目的片段大小為416 bp。

1.2.4 PCR擴增 PCR擴增反應體系采用25 μL反應體系。2×Premix Taq DNA酶12.5 μL，上下游引物（20 μmol/mL）各1 μL，DNA模板5 μL，滅菌水5.5 μL。PCR擴增程序為：94 ℃預變性2 min；94 ℃變性50 s，54 ℃退火90 s，72 ℃延伸2 min，35個循環；72 ℃延伸5 min；4 ℃ 30 min。PCR產物于0.8%的瓊脂糖凝膠中進行電泳分析。

1.2.5 測序與序列分析 將PCR產物用DNA回收試劑盒進行純化回收，并送寶生物工程（大連）有限公司進行測序。使用DNA Star軟件將測序結果與GenBank上公布的UL6基因序列進行比對分析。

1.2.6 鴨胚感染試驗 將16只9～10日齡的鴨胚隨機分為2組，每組8只。第一組每只鴨胚接種0.2 mL的病毒稀釋液。第二組每只鴨胚接種0.2 mL的無菌PBS液（陰性對照）。培養并觀察鴨胚死亡情況和病變情況。

2 結果與分析

2.1 鴨瘟病毒的PCR鑒定結果

用設計合成的針對鴨瘟病毒UL6基因核苷酸序列擴增引物對提取的鴨瘟病毒DNA進行PCR擴增后，擴增產物出現一條約416 bp大小的條帶，與預期片段大小相符（圖1）。

2.2 鴨瘟病毒UL6基因序列測定分析結果

將所測定的序列通過DNAMAN軟件與GenBank上公布的鴨瘟病毒UL6基因序列進行比對分析，結果表明所鑒定病毒的UL6基因序列與GenBank上公布的鴨瘟病毒UL6基因序列的相似性達到99%（圖2）。

2.3 鴨胚感染試驗結果

接種后4 d，攻毒組的鴨胚開始出現死亡，在第六天8只鴨胚全部死亡，而陰性對照組的鴨胚沒有出現死亡（圖3）。死亡的鴨胚全身水腫，出血，絨毛尿囊膜有灰白色壞死點，肝臟有壞死灶出現。

3 小結與討論

鴨瘟病毒在臨床上造成的死亡情況有較大的差別。不同年齡、性別和品種的鴨均易感。鴨瘟病毒感染鴨后，可侵害鴨的多種組織器官，為全身各組織感染和廣泛的組織嗜性創造條件[6]。本研究中送檢的病鴨拉綠色稀糞，泄殖腔嚴重充血、出血、水腫；食道黏膜出血，肝臟腫大，表面有灰白色的壞死點，心內膜與心外膜有出血斑點，這與報道的鴨瘟的臨床癥狀、病理變化等相一致[7]。進一步通過擴增鴨瘟的UL6基因和鴨胚感染試驗證實送檢的病例為鴨瘟病毒感染。

鴨瘟病毒的天然宿主為鴨、鵝和天鵝，7日齡到成年種鴨均可感染[1]。鴨瘟病毒不能直接使用于雞胚，因此本研究中感染動物為鴨胚。在本研究中，感染病毒的鴨胚在感染后4～6 d內全部死亡，鴨胚感染后出現典型的鴨瘟病毒感染的病理變化特征。

本研究中根據GenBank上已經公布的鴨瘟病毒UL6基因序列，設計合成一對引物，通過PCR方法特異性擴增出416 bp的片段。將擴增出的基因片段與公布的基因序列相比較，兩者的相似性為99%。但是，鴨瘟病毒的UL6基因序列在鴨瘟病毒的致病過程中起何作用還有待進一步研究。

參考文獻：

[1] SANDHU T S， SHAWKY S A. Duck virus enteritis （duck plague）[M]. Ames： Iowa State University Press， 2003.354-363.

[2] 張 坤，刁有祥，程彥麗，等.鴨瘟病毒強毒株感染SPF鴨后動態病理組織學變化[J].中國獸醫學報，2013，33（1）：9-15.

[3] 郭玉璞，蔣金書.鴨病[M].北京：北京農業大學出版社，1988. 21-28.

[4] 陳安莉，謝芝勛，謝麗基，等.新城疫病毒和鴨瘟病毒二重PCR檢測方法的建立及初步應用[J].中國畜牧獸醫，2013，40（11）： 192-195.

[5] 張艷芳，謝芝勛，謝麗基，等.鴨黃病毒和鴨瘟病毒二重熒光定量RT-PCR方法的建立[A].中國畜牧獸醫學會家畜傳染病學分會第十五次學術研討會論文集[C].北京：中國畜牧獸醫學會傳染病學分會，2013.899-903.

[6] 張 坤，刁有祥，程彥麗，等.鴨瘟病毒對SPF鴨的致病性研究[J].西北農林科技大學學報（自然科學版），2012，40（7）：51-58.

[7] 余愛花，楊 陽，張寶來，等.鴨瘟病毒YZH株的分離鑒定及其TK基因的序列分析[J].動物醫學進展，2012，33（12）：133-137.

1.2.3 引物設計與合成 根據GenBank上公布的鴨瘟病毒UL6基因序列設計一對PCR引物，引物由寶生物工程（大連）有限公司合成。上游引物P1：5′-GAGCGTATTTAGATGAAACTGC-3′，下游引物P2：5′-TGTTGTGATTGTTCC-3′。目的片段大小為416 bp。

1.2.4 PCR擴增 PCR擴增反應體系采用25 μL反應體系。2×Premix Taq DNA酶12.5 μL，上下游引物（20 μmol/mL）各1 μL，DNA模板5 μL，滅菌水5.5 μL。PCR擴增程序為：94 ℃預變性2 min；94 ℃變性50 s，54 ℃退火90 s，72 ℃延伸2 min，35個循環；72 ℃延伸5 min；4 ℃ 30 min。PCR產物于0.8%的瓊脂糖凝膠中進行電泳分析。

1.2.5 測序與序列分析 將PCR產物用DNA回收試劑盒進行純化回收，并送寶生物工程（大連）有限公司進行測序。使用DNA Star軟件將測序結果與GenBank上公布的UL6基因序列進行比對分析。

1.2.6 鴨胚感染試驗 將16只9～10日齡的鴨胚隨機分為2組，每組8只。第一組每只鴨胚接種0.2 mL的病毒稀釋液。第二組每只鴨胚接種0.2 mL的無菌PBS液（陰性對照）。培養并觀察鴨胚死亡情況和病變情況。

2 結果與分析

2.1 鴨瘟病毒的PCR鑒定結果

用設計合成的針對鴨瘟病毒UL6基因核苷酸序列擴增引物對提取的鴨瘟病毒DNA進行PCR擴增后，擴增產物出現一條約416 bp大小的條帶，與預期片段大小相符（圖1）。

2.2 鴨瘟病毒UL6基因序列測定分析結果

將所測定的序列通過DNAMAN軟件與GenBank上公布的鴨瘟病毒UL6基因序列進行比對分析，結果表明所鑒定病毒的UL6基因序列與GenBank上公布的鴨瘟病毒UL6基因序列的相似性達到99%（圖2）。

2.3 鴨胚感染試驗結果

接種后4 d，攻毒組的鴨胚開始出現死亡，在第六天8只鴨胚全部死亡，而陰性對照組的鴨胚沒有出現死亡（圖3）。死亡的鴨胚全身水腫，出血，絨毛尿囊膜有灰白色壞死點，肝臟有壞死灶出現。

3 小結與討論

鴨瘟病毒在臨床上造成的死亡情況有較大的差別。不同年齡、性別和品種的鴨均易感。鴨瘟病毒感染鴨后，可侵害鴨的多種組織器官，為全身各組織感染和廣泛的組織嗜性創造條件[6]。本研究中送檢的病鴨拉綠色稀糞，泄殖腔嚴重充血、出血、水腫；食道黏膜出血，肝臟腫大，表面有灰白色的壞死點，心內膜與心外膜有出血斑點，這與報道的鴨瘟的臨床癥狀、病理變化等相一致[7]。進一步通過擴增鴨瘟的UL6基因和鴨胚感染試驗證實送檢的病例為鴨瘟病毒感染。

鴨瘟病毒的天然宿主為鴨、鵝和天鵝，7日齡到成年種鴨均可感染[1]。鴨瘟病毒不能直接使用于雞胚，因此本研究中感染動物為鴨胚。在本研究中，感染病毒的鴨胚在感染后4～6 d內全部死亡，鴨胚感染后出現典型的鴨瘟病毒感染的病理變化特征。

本研究中根據GenBank上已經公布的鴨瘟病毒UL6基因序列，設計合成一對引物，通過PCR方法特異性擴增出416 bp的片段。將擴增出的基因片段與公布的基因序列相比較，兩者的相似性為99%。但是，鴨瘟病毒的UL6基因序列在鴨瘟病毒的致病過程中起何作用還有待進一步研究。

參考文獻：

[1] SANDHU T S， SHAWKY S A. Duck virus enteritis （duck plague）[M]. Ames： Iowa State University Press， 2003.354-363.

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[4] 陳安莉，謝芝勛，謝麗基，等.新城疫病毒和鴨瘟病毒二重PCR檢測方法的建立及初步應用[J].中國畜牧獸醫，2013，40（11）： 192-195.

[5] 張艷芳，謝芝勛，謝麗基，等.鴨黃病毒和鴨瘟病毒二重熒光定量RT-PCR方法的建立[A].中國畜牧獸醫學會家畜傳染病學分會第十五次學術研討會論文集[C].北京：中國畜牧獸醫學會傳染病學分會，2013.899-903.

[6] 張 坤，刁有祥，程彥麗，等.鴨瘟病毒對SPF鴨的致病性研究[J].西北農林科技大學學報（自然科學版），2012，40（7）：51-58.

[7] 余愛花，楊 陽，張寶來，等.鴨瘟病毒YZH株的分離鑒定及其TK基因的序列分析[J].動物醫學進展，2012，33（12）：133-137.

1.2.3 引物設計與合成 根據GenBank上公布的鴨瘟病毒UL6基因序列設計一對PCR引物，引物由寶生物工程（大連）有限公司合成。上游引物P1：5′-GAGCGTATTTAGATGAAACTGC-3′，下游引物P2：5′-TGTTGTGATTGTTCC-3′。目的片段大小為416 bp。

1.2.4 PCR擴增 PCR擴增反應體系采用25 μL反應體系。2×Premix Taq DNA酶12.5 μL，上下游引物（20 μmol/mL）各1 μL，DNA模板5 μL，滅菌水5.5 μL。PCR擴增程序為：94 ℃預變性2 min；94 ℃變性50 s，54 ℃退火90 s，72 ℃延伸2 min，35個循環；72 ℃延伸5 min；4 ℃ 30 min。PCR產物于0.8%的瓊脂糖凝膠中進行電泳分析。

1.2.5 測序與序列分析 將PCR產物用DNA回收試劑盒進行純化回收，并送寶生物工程（大連）有限公司進行測序。使用DNA Star軟件將測序結果與GenBank上公布的UL6基因序列進行比對分析。

1.2.6 鴨胚感染試驗 將16只9～10日齡的鴨胚隨機分為2組，每組8只。第一組每只鴨胚接種0.2 mL的病毒稀釋液。第二組每只鴨胚接種0.2 mL的無菌PBS液（陰性對照）。培養并觀察鴨胚死亡情況和病變情況。

2 結果與分析

2.1 鴨瘟病毒的PCR鑒定結果

用設計合成的針對鴨瘟病毒UL6基因核苷酸序列擴增引物對提取的鴨瘟病毒DNA進行PCR擴增后，擴增產物出現一條約416 bp大小的條帶，與預期片段大小相符（圖1）。

2.2 鴨瘟病毒UL6基因序列測定分析結果

將所測定的序列通過DNAMAN軟件與GenBank上公布的鴨瘟病毒UL6基因序列進行比對分析，結果表明所鑒定病毒的UL6基因序列與GenBank上公布的鴨瘟病毒UL6基因序列的相似性達到99%（圖2）。

2.3 鴨胚感染試驗結果

接種后4 d，攻毒組的鴨胚開始出現死亡，在第六天8只鴨胚全部死亡，而陰性對照組的鴨胚沒有出現死亡（圖3）。死亡的鴨胚全身水腫，出血，絨毛尿囊膜有灰白色壞死點，肝臟有壞死灶出現。

3 小結與討論

鴨瘟病毒在臨床上造成的死亡情況有較大的差別。不同年齡、性別和品種的鴨均易感。鴨瘟病毒感染鴨后，可侵害鴨的多種組織器官，為全身各組織感染和廣泛的組織嗜性創造條件[6]。本研究中送檢的病鴨拉綠色稀糞，泄殖腔嚴重充血、出血、水腫；食道黏膜出血，肝臟腫大，表面有灰白色的壞死點，心內膜與心外膜有出血斑點，這與報道的鴨瘟的臨床癥狀、病理變化等相一致[7]。進一步通過擴增鴨瘟的UL6基因和鴨胚感染試驗證實送檢的病例為鴨瘟病毒感染。

鴨瘟病毒的天然宿主為鴨、鵝和天鵝，7日齡到成年種鴨均可感染[1]。鴨瘟病毒不能直接使用于雞胚，因此本研究中感染動物為鴨胚。在本研究中，感染病毒的鴨胚在感染后4～6 d內全部死亡，鴨胚感染后出現典型的鴨瘟病毒感染的病理變化特征。

本研究中根據GenBank上已經公布的鴨瘟病毒UL6基因序列，設計合成一對引物，通過PCR方法特異性擴增出416 bp的片段。將擴增出的基因片段與公布的基因序列相比較，兩者的相似性為99%。但是，鴨瘟病毒的UL6基因序列在鴨瘟病毒的致病過程中起何作用還有待進一步研究。

參考文獻：

[1] SANDHU T S， SHAWKY S A. Duck virus enteritis （duck plague）[M]. Ames： Iowa State University Press， 2003.354-363.

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[3] 郭玉璞，蔣金書.鴨病[M].北京：北京農業大學出版社，1988. 21-28.

[4] 陳安莉，謝芝勛，謝麗基，等.新城疫病毒和鴨瘟病毒二重PCR檢測方法的建立及初步應用[J].中國畜牧獸醫，2013，40（11）： 192-195.

[5] 張艷芳，謝芝勛，謝麗基，等.鴨黃病毒和鴨瘟病毒二重熒光定量RT-PCR方法的建立[A].中國畜牧獸醫學會家畜傳染病學分會第十五次學術研討會論文集[C].北京：中國畜牧獸醫學會傳染病學分會，2013.899-903.

[6] 張 坤，刁有祥，程彥麗，等.鴨瘟病毒對SPF鴨的致病性研究[J].西北農林科技大學學報（自然科學版），2012，40（7）：51-58.

[7] 余愛花，楊 陽，張寶來，等.鴨瘟病毒YZH株的分離鑒定及其TK基因的序列分析[J].動物醫學進展，2012，33（12）：133-137.