酶法提取山豆根總黃酮的工藝研究

賴紅芳+鄧晰朝+歐陽淼

摘要：為了研究酶法提取山豆根（Sophora tonkinensis Gapnep）總黃酮的最佳工藝條件，對(duì)3種酶（纖維素酶、果膠酶、纖維素酶與果膠酶的復(fù)合酶）提取山豆根總黃酮的效果進(jìn)行了比較，選用纖維素酶為提取劑，以山豆根總黃酮得率為考察指標(biāo)，分別對(duì)4個(gè)提取參數(shù)（提取液pH、提取時(shí)間、提取溫度及酶加量）進(jìn)行單因素試驗(yàn)，然后采用正交試驗(yàn)對(duì)提取條件進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明，山豆根總黃酮的最佳提取條件為：酶加量0.5%、提取溫度70 ℃、提取時(shí)間1.5 h、提取液pH 4.0，在此條件下，山豆根總黃酮的提取率可達(dá)到0.73%。該結(jié)果可為開發(fā)利用山豆根植物資源提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：山豆根（Sophora tonkinensis Gapnep）；纖維素酶；總黃酮

中圖分類號(hào)：R284.2；Q946.8 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2014）19-4657-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2014.19.040

The Technology of Extracting flavonoids from Sophora tonkinensis Gapnep

with Enzymatic Method

LAI Hong-fang，DENG Xi-chao，OU-YANG Miao

（Department of Chemistry and Life Sciences， Hechi University，Yizhou 546300，Guangxi，China）

Abstract： To study the optimal technology of extracting total flavonoids from Sophora tonkinensis gapnep， three kinds of enzymes including cellulose enzyme， pectinase and the compound of two enzymes were used to compare the extraction effect with single factor test and orthogonal design. The extraction parameters included pH，enzymatic time， enzymatic temperature and enzyme amount. The results showed that the yield of total flavone extracted from Sophora tonkinensis gapnep were 0.73% under the optimal conditions of enzymolysis 1.5 hours under 70 ℃ and pH of 4.0 with the enzyme amount of 0.5%. It will provide a reference for developing Sophora tonkinensis Gapnep.

Key words： Sophora tonkinensis Gapnep； cellulose enzyme； total flavonoids

山豆根（Sophora tonkinensis Gapnep）又名廣豆根、柔枝槐、苦豆根等，為豆科蔓生矮小灌木植物越南槐的根，主產(chǎn)于廣西西南部至西北部[1]。山豆根的藥用功效始載于唐代《開寶本草》，其藥性苦寒、有毒、歸肺、胃經(jīng)，具有清熱解毒、利咽消腫的功效，近代臨床常用于治療咽喉腫痛、牙齦腫痛、濕熱黃疽、濕熱帶下、心律失常等癥[2]。山豆根中含有豐富的生物堿、黃酮類成分[1，3，4]，主要為黃酮、二氫黃酮異黃酮、查耳酮和紫檀素類化合物，以二氫黃酮類化合物最為豐富。黃酮類化合物具有多種生物活性，能起到抗菌、抗病毒、抗腫瘤、抗氧化自由基、抗炎、鎮(zhèn)痛、保肝等功效[5]。

目前提取黃酮的方法主要有有機(jī)溶劑、水或熱水提取、酶解、二氧化碳超臨界提取、大孔樹脂吸附提取等[6]，其中有機(jī)溶劑、水或熱水提取法存在排污量大、有效成分損失多、提取效率低等缺點(diǎn)；二氧化碳超臨界提取法一次性投資大、成本高；大孔樹脂吸附法使有機(jī)溶劑難以回收，損耗大、成本高、易燃易爆、對(duì)環(huán)境污染嚴(yán)重[7]；酶解法的污染小、作用條件溫和、高效安全，提取率比其他方法提高了2%～3%[8]。因此，本試驗(yàn)采用酶法提取山豆根中總黃酮，通過比較幾種酶的提取效果，篩選出高效率的酶；同時(shí)，采用單因素試驗(yàn)分析提取溫度、提取液pH、酶加量、提取時(shí)間4個(gè)主要因素對(duì)山豆根總黃酮提取率的影響，并在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上通過正交試驗(yàn)法優(yōu)化了山豆根總黃酮提取工藝條件，對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，探究出從山豆根中提取黃酮類化合物的最佳工藝流程，以期為山豆根的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試驗(yàn)用山豆根購于廣西宜州市中藥市場，經(jīng)河池學(xué)院鄧晰朝副教授鑒定為豆科蔓生矮小灌木植物越南槐的根。

蘆丁（Rutin）標(biāo)準(zhǔn)品（UV≥98%，批號(hào)20110825）；纖維素酶（活性≥1 400 U/mg）、果膠酶（活性≥1 000 U/mg），上海源葉生物科技有限公司；無水乙醇、磷酸氫二鈉、檸檬酸、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、鎂粉、三氯化鋁、濃鹽酸均為分析純。

1.2 儀器

UV-2102PCS型紫外分光光度計(jì)[尤尼科（上海）儀器有限公司）]；pHS-3B型pH計(jì)（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；SHB—Ⅲ型循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長城科工貿(mào)易有限公司）；SSY4型電熱恒溫水浴鍋（北京泰克儀器有限公司）；DGF30/14-22A型電熱鼓風(fēng)干燥箱（南京實(shí)驗(yàn)儀器廠）；FZ102型微型植物粉碎機(jī)（天津市泰斯特儀器有限公司）；AE240S型電子分析天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 山豆根總黃酮提取工藝流程 山豆根干燥，粉碎（過30目篩）→稱重→溶解→調(diào)節(jié)pH→添加酶→恒溫水浴→高溫滅酶→過濾→定容→顯色，測吸光度。

1.3.2 樣品溶液的制備 準(zhǔn)確稱取20.00 g山豆根粉末于500 mL的圓底燒瓶中，按料液比（g/mL，下同）1∶15加入蒸餾水溶解，調(diào)節(jié)pH，放置一定溫度水浴5 min后，加入酶并恒溫水浴，提取一定時(shí)間后，100 ℃高溫滅酶，冷卻，抽濾，濾液置于500 mL的容量瓶，用80%乙醇溶液定容至刻度，搖勻備用。

1.3.3 酶的篩選試驗(yàn) 準(zhǔn)確稱取4份20.00 g山豆根粉末于500 mL的圓底燒瓶中，按照“1.3.2”的步驟，考察在料液比1∶15、提取液pH 5.0、提取溫度50 ℃、提取時(shí)間1.5 h的條件下，分別加入1.5%纖維素酶、果膠酶、纖維素酶與果膠酶的復(fù)合酶（配合比為1∶1）（同時(shí)設(shè)置傳統(tǒng)醇提法為空白對(duì)照）對(duì)山豆根總黃酮得率的影響[9]，以篩選出最適酶解的酶用于下一步試驗(yàn)。

1.3.4 酶解最佳條件的確定[10] 考察不同的酶加量（酶加量=酶用量/山豆根的質(zhì)量×100%）（0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%）、提取液pH（3.0、4.0、5.0、6.0、7.0）、提取溫度（30、40、50、60、70 ℃）、提取時(shí)間（1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h）對(duì)山豆根總黃酮提取效果的影響。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上進(jìn)行正交試驗(yàn)來確定酶法提取山豆根總黃酮的最佳工藝條件。正交試驗(yàn)因素與水平見表1。

1.3.5 山豆根總黃酮含量測定

1）蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備。精確稱取20.0 mg的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，用80%的乙醇溶液微熱溶解，待完全溶解后，用80%的乙醇溶液定容于200 mL的容量瓶中，搖勻，制備成0.1 mg/mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

2）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。精確量取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL分別加入25 mL比色管中， 加入5%的亞硝酸鈉溶液0.25 mL，搖勻，放置6 min，然后加入10%的硝酸鋁溶液0.25 mL，搖勻， 放置6 min，再加入4%的氫氧化鈉溶液2.5 mL， 用80%的乙醇溶液定容至10 mL，搖勻，室溫放置15 min后，以試劑空白做參比，在510 nm處測定其吸光度，以蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液濃度C（mg/mL）為橫坐標(biāo)，吸光度A為縱坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為：A=14.714C+0.001 9，r=0.999 8，表明蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液濃度和吸光度呈良好的線性關(guān)系。

3）樣品中總黃酮含量的測定方法。取“1.3.2”中的樣品提取液2 mL于3個(gè)平行的25 mL比色管中，按上述操作測其吸光度，按照回歸方程計(jì)算出樣品中總黃酮的含量，并計(jì)算總黃酮得率。

山豆根總黃酮得率=[C×V×D]/（m×1 000）×100%

上式中，C為樣品中總黃酮的含量（mg/mL），V為樣品溶液體積（mL），D為稀釋倍數(shù)，m為樣品山豆根的質(zhì)量（g）。

1.3.6 驗(yàn)證試驗(yàn) 準(zhǔn)確稱取5份20.00 g山豆根，按料液比1∶15加入蒸餾水溶解，用正交試驗(yàn)得出的最佳提取工藝條件進(jìn)行提取，按“1.3.5”的操作方法測定其吸光率，計(jì)算其總黃酮含量，并計(jì)算總黃酮得率。

1.3.7 加標(biāo)回收試驗(yàn) 準(zhǔn)確稱取20.00 g已知總黃酮含量的山豆根5份，分別加入5 mL 0.1 mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按最佳提取工藝條件進(jìn)行提取，得樣品提取液后，按“1.3.5”的操作方法分別測其吸光度，根據(jù)回歸方程，分別計(jì)算山豆根樣品加標(biāo)樣后其總黃酮含量，按以下公式計(jì)算回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。回收率=（加標(biāo)樣后測得的樣品中總黃酮質(zhì)量-加標(biāo)樣前樣品中總黃酮質(zhì)量）/蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品的加入量×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶的篩選結(jié)果

由表2可見，與傳統(tǒng)醇提法（空白對(duì)照）相比較，添加不同的酶后山豆根總黃酮的得率均有所增加，其中以添加纖維素酶時(shí)山豆根總黃酮的得率最高，主要是由于纖維素酶破壞了細(xì)胞壁，使細(xì)胞內(nèi)的黃酮得以釋放。因此，選擇纖維素酶作為山豆根總黃酮提取的適用酶。

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 酶加量對(duì)山豆根總黃酮得率的影響 在提取液pH 5.0、提取溫度50 ℃、提取時(shí)間1.5 h的條件下，考察不同的酶加量（0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%）對(duì)山豆根總黃酮得率的影響，其結(jié)果見圖1。由圖1可知，隨著纖維素酶用量的加大，山豆根總黃酮得率變化不大，在纖維素酶加量為1.0%時(shí)山豆根總黃酮得率達(dá)到最大值，之后再增大酶加量，其得率保持在一定水平并略有下降。分析其原因是酶量過高時(shí)，底物濃度不能對(duì)酶達(dá)到飽和，致使酶的作用受到抑制[11]。因此，酶加量以1.0%為宜。

2.2.2 提取液pH對(duì)山豆根總黃酮得率的影響 在酶加量1.0%、提取溫度50 ℃、提取時(shí)間1.5 h的條件下，考察提取液不同pH（3.0、4.0、5.0、6.0、7.0）對(duì)山豆根總黃酮得率的影響，其結(jié)果見圖2。由圖2可知，在提取液pH為3.0～4.0時(shí)山豆根總黃酮得率迅速增加，在pH 5.0時(shí)達(dá)到最大值，之后隨提取液pH的進(jìn)一步增加，山豆根總黃酮得率開始下降，表明微酸性條件下纖維素酶的活性最大。因此，提取液pH以5.0為宜。

2.2.3 提取溫度對(duì)山豆根總黃酮得率的影響 在提取液pH 5.0、酶加量1.0%、提取時(shí)間1.5 h的條件下，考察不同的提取溫度（30、40、50、60、70 ℃）對(duì)山豆根總黃酮得率的影響，其結(jié)果見圖3。由圖3可知，隨著提取溫度的增加，山豆根總黃酮的得率也逐漸增大，在60 ℃時(shí)達(dá)到最高，之后隨提取溫度的繼續(xù)增加，其總黃酮得率呈下降趨勢。分析其原因可能是高溫下蛋白質(zhì)容易變性，酶的活性受到了影響。因此，提取溫度選擇60 ℃為宜。

2.2.4 提取時(shí)間對(duì)山豆根總黃酮得率的影響 在提取液pH 5.0、酶加量1.0%、提取溫度60 ℃的條件下，考察不同的提取時(shí)間（1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h）對(duì)山豆根總黃酮得率的影響，其結(jié)果見圖4。由圖4可知，提取時(shí)間為1.5 h時(shí)山豆根總黃酮的得率最高，之后隨著提取時(shí)間的進(jìn)一步延長，山豆根總黃酮的得率反而下降。分析其原因可能是由于提取時(shí)間太長不僅會(huì)使酶的活性降低，也引起樣品中的黃酮結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，最終使總黃酮含量降低，所以提取時(shí)間以1.5 h為宜。

2.3 正交試驗(yàn)結(jié)果

正交試驗(yàn)結(jié)果見表3。從表3可知，各因素對(duì)總黃酮得率的影響順序?yàn)椋篊（提取時(shí)間）>D（提取液pH）>A（酶加量）>B（提取溫度）；山豆根總黃酮提取最佳工藝條件組合為A1B3C2D1，即酶加量0.5%、提取溫度70 ℃、提取時(shí)間1.5 h、提取液pH 4.0。

2.4 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果表明，山豆根總黃酮的得率分別為0.74%、0.72%、0.72%、0.73%、0.74%，平均得率為0.73%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.24%。由此可知，按最佳提取工藝條件所得山豆根總黃酮得率明顯高于單因素和正交試驗(yàn)的結(jié)果，表明該最佳提取工藝條件可行。

2.5 加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果

加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果見表4。由表4可知，山豆根總黃酮的平均加標(biāo)回收率為98.84%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.25%，符合加標(biāo)回收的要求。因此，分析結(jié)果是準(zhǔn)確的。

3 小結(jié)與討論

本試驗(yàn)首先對(duì)纖維素酶、果膠酶及其復(fù)合酶提取山豆根總黃酮的效果進(jìn)行比較，由試驗(yàn)結(jié)果可知纖維素酶處理山豆根的效果最好，對(duì)山豆根總黃酮得率的影響最顯著。因此，篩選出纖維素酶作為試驗(yàn)用酶，通過單因素試驗(yàn)，考察了酶加量、提取液pH、提取溫度和提取時(shí)間4個(gè)因素對(duì)山豆根總黃酮得率的影響，在此基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)4因素3水平正交試驗(yàn)，得到山豆根總黃酮最佳提取工藝條件為：酶加量0.5%、提取溫度70 ℃、提取時(shí)間1.5 h、提取液pH 4.0。在此條件下，山豆根總黃酮得率可達(dá)到0.73%，與醇提法相比有明顯提高，說明纖維素酶具有反應(yīng)條件溫和、選擇性高的特點(diǎn)，酶的專一性又避免了對(duì)底物外物質(zhì)的破壞，減少了中藥材中有效成分溶出及溶劑提取時(shí)的傳質(zhì)阻力，縮短了提取時(shí)間，提高了提取率從而使有效成分容易溶出[12，13]，這些都將有利于山豆根資源的進(jìn)一步高效利用。

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2.2.4 提取時(shí)間對(duì)山豆根總黃酮得率的影響 在提取液pH 5.0、酶加量1.0%、提取溫度60 ℃的條件下，考察不同的提取時(shí)間（1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h）對(duì)山豆根總黃酮得率的影響，其結(jié)果見圖4。由圖4可知，提取時(shí)間為1.5 h時(shí)山豆根總黃酮的得率最高，之后隨著提取時(shí)間的進(jìn)一步延長，山豆根總黃酮的得率反而下降。分析其原因可能是由于提取時(shí)間太長不僅會(huì)使酶的活性降低，也引起樣品中的黃酮結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，最終使總黃酮含量降低，所以提取時(shí)間以1.5 h為宜。

2.3 正交試驗(yàn)結(jié)果

正交試驗(yàn)結(jié)果見表3。從表3可知，各因素對(duì)總黃酮得率的影響順序?yàn)椋篊（提取時(shí)間）>D（提取液pH）>A（酶加量）>B（提取溫度）；山豆根總黃酮提取最佳工藝條件組合為A1B3C2D1，即酶加量0.5%、提取溫度70 ℃、提取時(shí)間1.5 h、提取液pH 4.0。

2.4 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果表明，山豆根總黃酮的得率分別為0.74%、0.72%、0.72%、0.73%、0.74%，平均得率為0.73%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.24%。由此可知，按最佳提取工藝條件所得山豆根總黃酮得率明顯高于單因素和正交試驗(yàn)的結(jié)果，表明該最佳提取工藝條件可行。

2.5 加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果

加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果見表4。由表4可知，山豆根總黃酮的平均加標(biāo)回收率為98.84%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.25%，符合加標(biāo)回收的要求。因此，分析結(jié)果是準(zhǔn)確的。

3 小結(jié)與討論

本試驗(yàn)首先對(duì)纖維素酶、果膠酶及其復(fù)合酶提取山豆根總黃酮的效果進(jìn)行比較，由試驗(yàn)結(jié)果可知纖維素酶處理山豆根的效果最好，對(duì)山豆根總黃酮得率的影響最顯著。因此，篩選出纖維素酶作為試驗(yàn)用酶，通過單因素試驗(yàn)，考察了酶加量、提取液pH、提取溫度和提取時(shí)間4個(gè)因素對(duì)山豆根總黃酮得率的影響，在此基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)4因素3水平正交試驗(yàn)，得到山豆根總黃酮最佳提取工藝條件為：酶加量0.5%、提取溫度70 ℃、提取時(shí)間1.5 h、提取液pH 4.0。在此條件下，山豆根總黃酮得率可達(dá)到0.73%，與醇提法相比有明顯提高，說明纖維素酶具有反應(yīng)條件溫和、選擇性高的特點(diǎn)，酶的專一性又避免了對(duì)底物外物質(zhì)的破壞，減少了中藥材中有效成分溶出及溶劑提取時(shí)的傳質(zhì)阻力，縮短了提取時(shí)間，提高了提取率從而使有效成分容易溶出[12，13]，這些都將有利于山豆根資源的進(jìn)一步高效利用。

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2.2.4 提取時(shí)間對(duì)山豆根總黃酮得率的影響 在提取液pH 5.0、酶加量1.0%、提取溫度60 ℃的條件下，考察不同的提取時(shí)間（1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h）對(duì)山豆根總黃酮得率的影響，其結(jié)果見圖4。由圖4可知，提取時(shí)間為1.5 h時(shí)山豆根總黃酮的得率最高，之后隨著提取時(shí)間的進(jìn)一步延長，山豆根總黃酮的得率反而下降。分析其原因可能是由于提取時(shí)間太長不僅會(huì)使酶的活性降低，也引起樣品中的黃酮結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，最終使總黃酮含量降低，所以提取時(shí)間以1.5 h為宜。

2.3 正交試驗(yàn)結(jié)果

正交試驗(yàn)結(jié)果見表3。從表3可知，各因素對(duì)總黃酮得率的影響順序?yàn)椋篊（提取時(shí)間）>D（提取液pH）>A（酶加量）>B（提取溫度）；山豆根總黃酮提取最佳工藝條件組合為A1B3C2D1，即酶加量0.5%、提取溫度70 ℃、提取時(shí)間1.5 h、提取液pH 4.0。

2.4 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果表明，山豆根總黃酮的得率分別為0.74%、0.72%、0.72%、0.73%、0.74%，平均得率為0.73%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.24%。由此可知，按最佳提取工藝條件所得山豆根總黃酮得率明顯高于單因素和正交試驗(yàn)的結(jié)果，表明該最佳提取工藝條件可行。

2.5 加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果

加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果見表4。由表4可知，山豆根總黃酮的平均加標(biāo)回收率為98.84%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.25%，符合加標(biāo)回收的要求。因此，分析結(jié)果是準(zhǔn)確的。

3 小結(jié)與討論

本試驗(yàn)首先對(duì)纖維素酶、果膠酶及其復(fù)合酶提取山豆根總黃酮的效果進(jìn)行比較，由試驗(yàn)結(jié)果可知纖維素酶處理山豆根的效果最好，對(duì)山豆根總黃酮得率的影響最顯著。因此，篩選出纖維素酶作為試驗(yàn)用酶，通過單因素試驗(yàn)，考察了酶加量、提取液pH、提取溫度和提取時(shí)間4個(gè)因素對(duì)山豆根總黃酮得率的影響，在此基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)4因素3水平正交試驗(yàn)，得到山豆根總黃酮最佳提取工藝條件為：酶加量0.5%、提取溫度70 ℃、提取時(shí)間1.5 h、提取液pH 4.0。在此條件下，山豆根總黃酮得率可達(dá)到0.73%，與醇提法相比有明顯提高，說明纖維素酶具有反應(yīng)條件溫和、選擇性高的特點(diǎn)，酶的專一性又避免了對(duì)底物外物質(zhì)的破壞，減少了中藥材中有效成分溶出及溶劑提取時(shí)的傳質(zhì)阻力，縮短了提取時(shí)間，提高了提取率從而使有效成分容易溶出[12，13]，這些都將有利于山豆根資源的進(jìn)一步高效利用。

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