獨活總香豆素類成分的純化工藝研究

王曉林+徐茂林+鐘方麗+薛健飛+李晶

摘要：利用大孔吸附樹脂對獨活（Heracleum hemsleyanum Diels）中的總香豆素類成分進行純化。采用靜態與動態吸附-解吸相結合的方法，以解吸量及解吸率為主要指標對工藝條件進行優化，確定了最佳純化工藝條件。結果表明，采用LX-36型大孔吸附樹脂純化效果較好，其最佳工藝條件為上柱藥液濃度相當于原藥0.1 g/mL，上柱藥液pH為2.5～5.5，吸附速率為5 BV/h，上樣量相當于樹脂量的50%，解吸液乙醇體積分數為95%，解吸速率為1 BV/h，解吸液用量為5 BV，經LX-36型大孔吸附樹脂分離純化后的獨活干浸膏中總香豆素的含量由原來的8.42%升高到27.09%。表明LX-36型大孔吸附樹脂適于獨活總香豆素的初步純化。

關鍵詞： 獨活（Heracleum hemsleyanum Diels）；總香豆素；純化；大孔吸附樹脂

中圖分類號：R284.2 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2014）19-4679-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2014.19.045

Technology of Purifying Total Coumarins in Heracleum hemsleyanum Diels

WANG Xiao-lin，XU Mao-lin，ZHONG Fang-li，XUE Jian-fei，LI Jing

（School of Chemistry and Pharmaceutical Engineering， Jilin Institute of Chemical Technology， Jilin 132022，Jilin，China）

Abstract： The technology of purifying total coumarins（TC） in Heracleum hemsleyanum Diels with macroporous adsorption resin was optimized. Using static and dynamic state combined with desorption amount and desorption ratio method， the optimum purification conditions with macroporous adsorption resin were determined using adsorption and desorption rate of TC as evaluating indicators. The results showed that LX-36 macroporous adsorption resin had better purification effect than others. The TC content of the sample（equal to raw material）， pH value of sample， adsorption rate， amount of sample， ethanol content， desorption rate， the volume of eluant were 0.1 g/mL， 2.5 to 5.5， 5 BV/h， 50%（equal to the resin），95%， 1 BV/h， and 5 BV， respectively. Under these conditions， the purity of TC varied from 8.42% to 27.09%. It is indicated that LX-36 macroporous adsorption resin was suitable for initial purification of TC in Heracleum hemsleyanum Diels.

Key words： Heracleum hemsleyanum Diels；total coumarins； purification； macroporous adsorption resin

獨活（Heracleum hemsleyanum Diels）是傘形科植物重齒毛當歸的干燥根，多生于陰濕山坡、林下草叢中或稀疏灌叢間，為常用中藥材[1]。現代藥理學研究表明，獨活具有鎮靜、催眠、鎮痛、抗炎、抗氧化、延緩腦老化、抗血小板凝集、抗腫瘤等多種活性[2-4]，獨活主要含有香豆素、揮發油、皂苷和黃酮等化學成分[5，6]，其中香豆素類化合物是其主要化學成分之一。香豆素類化合物是植物次生代謝產物，該類化合物在醫藥、農業等領域有廣泛應用，如可以作為植物保護素，調節植物生長；抑制病原微生物、殺蟲、抑菌等[7]。香豆素類化合物還具有抗艾滋病、抗腫瘤、抗菌、降壓、抗輻射等多方面的生物活性[8]。大孔吸附樹脂是近年來發展起來的一類具有強吸附能力的高分子聚合物，具有吸附容量大、吸附迅速、解吸容易、再生效果好、使用周期長等優點，因而被廣泛地應用于天然產物有效成分的提取、分離與純化[9，10]。

本試驗對獨活總香豆素的吸附和解吸性能、大孔吸附樹脂柱純化獨活總香豆素工藝條件進行研究，以期為開發、利用獨活資源提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料

獨活購自安徽省亳州市華申藥業有限公司。

1.2 試劑和儀器

蛇床子素，中國藥品生物制品檢定所；大孔吸附樹脂（LSA-21型、LSA-10型、AB-8型、LX-36型、D-101型、LSA-33型），西安藍曉科技有限公司；硝酸鋁、氫氧化鈉、亞硝酸鈉、無水乙醇均為分析純，天津市大茂化學試劑廠。

旋轉蒸發儀（RE-52AA型），上海亞榮生化儀器廠；紫外可見分光光度計（752N型）、電子天平（JY2002型），上海精密科學儀器有限公司；電熱鼓風干燥箱（CS101-AB型），中國重慶實驗設備廠；循環水真空泵（SHZ-D型），河南省鞏義市英峪儀器一廠。

1.3 方法

1.3.1 標準曲線的繪制 精確稱取干燥至恒重的蛇床子素對照品10.0 mg，置于50 mL容量瓶中，加入無水甲醇適量，超聲處理使其溶解，無水甲醇定容至刻度，制成濃度為0.2 mg/mL的蛇床子素對照品溶液。精確吸取上述蛇床子素對照品溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL分別置于10 mL容量瓶中，加無水甲醇至刻度，以無水甲醇為空白，采用紫外分光光度法于波長322 nm處測定其吸光度[11]。以濃度為橫坐標，吸光度值為縱坐標，繪制標準曲線。得到的線性方程為A=0.078 73C+0.090 4，R=0.999 4，表明蛇床子素濃度在2.0～12.0 μg/mL范圍內呈良好的線性關系。

1.3.2 大孔吸附樹脂的預處理 稱取大孔吸附樹脂LX-36、LSA-33、LSA-10、D-101、AB-8和LSA-21各50 g，加入玻璃樹脂柱內，先以95%乙醇連續洗滌數次約2 h，直至流出液加去離子水（1∶5，V∶V）不混濁為止，然后采用去離子水洗滌至無醇味，再用5%HCl溶液浸泡4 h后以4～6 BV/h的流速洗滌2 h，再用去離子水洗至中性，最后用2%NaOH溶液浸泡6 h后以4～6 BV/h洗滌2 h，再用去離子水洗至中性，抽濾至干，置于密閉容器中備用[12]。

1.3.3 獨活總香豆素上柱液的制備 取獨活粗粉25 g，加15倍量80%乙醇加熱回流提取3次，每次1.5 h，過濾，合并濾液，減壓濃縮至無醇味，蒸餾水定容至250 mL，搖勻，備用。

1.3.4 樹脂類型的選擇

1）靜態吸附及解吸。稱取處理后的濕樹脂LX-36、LSA-33、LSA-10、D-101、AB-8、LSA-21各2 g，加入到100 mL具塞三角瓶中，加入40 mL總香豆素濃度為2.142 mg/mL的獨活提取液，每10 min振搖1次約30 s，共2 h，靜止48 h過濾，吸取各樹脂吸附后的溶液0.5 mL用于測定。將靜態吸附的樹脂抽濾至干，加入100 mL 95%乙醇解吸，每10 min振搖1次約30 s，持續2 h，靜置48 h過濾[13]，吸取各解吸液0.5 mL用于測定。按照“1.3.1”的方法于波長322 nm處測定吸光度A，計算各樹脂對獨活總香豆素的吸附率和解吸率。各指標的計算公式如下[14]：

吸附率=[（C0×V0-C1×V1）/C0×V0]×100%

吸附量=C0×V0-C1×V1

解吸率={（V2× C2）/[C0×V0-C1×V1]}×100%

解吸量=V2 × C2

純度=（m2/m1）×100%

式中，C0為起始提取液中總香豆素濃度（mg/mL）；C1為吸附48 h后溶液中總香豆素濃度（mg/mL）；C2為解吸液中總香豆素濃度（mg/mL）；V1為提取液體積（mL）；V2為解吸液體積（mL）；m1為解吸液干燥后固體的稱樣量（mg）；m2為解吸液中總香豆素的測定量（mg）。

2）動態吸附及解吸。稱取處理后樹脂LX-36、AB-8、LSA-21各4 g，濕法上柱，分別加入40 mL總香豆素濃度為2.138 mg/mL的獨活提取液，以2 BV/h的流速進行動態吸附，收集吸附后的溶液，吸取各吸附后的溶液適量，按照“1.3.1”的方法于波長322 nm處測定吸光度，再用50 mL 95%乙醇以2 BV/h的流速進行動態解吸，分別收集各解吸液，吸取各解吸液適量，按照“1.3.1”的方法于波長322 nm處測定吸光度，分別計算獨活總香豆素的動態吸附率和解吸率。

1.3.5 吸附樹脂工藝的優化

1）上樣量。取已處理的LX-36型大孔吸附樹脂6 g，濕法上柱，加入獨活提取液（總香豆素濃度為2.186 mg/mL），以2 BV/h的流速進行吸附，每10 mL收集一份吸附后溶液，共5份，然后每5 mL收集一份吸附后溶液，共7份，按照“1.3.1”的方法于322 nm處測定每份吸附后溶液的吸光度，計算濃度，以吸附后溶液濃度為縱坐標，吸附后溶液體積為橫坐標繪制泄漏曲線[15]。

2）提取液上樣濃度。取已處理的LX-36型大孔吸附樹脂5份，每份各6 g，濕法上柱，分別加入獨活提取液（總香豆素濃度為4.301 mg/mL）以及稀釋了1～4倍的獨活提取液各15、30、45、60、75 mL，以2 BV/h的流速進行吸附后，分別收集吸附后溶液并記錄體積用于測定。

3）上柱吸附速率。取已處理的LX-36型大孔吸附樹脂5份，每份各6 g，濕法上柱，分別加入獨活提取液各30 mL（總香豆素濃度為2.151 mg/mL），分別以1、2、3、4、5 BV/h的流速進行吸附，收集吸附后溶液并記錄體積用于測定。

4）提取液pH。取已處理的LX-36型大孔吸附樹脂8份，每份各6 g，濕法上柱，準備獨活提取液8份，每份30 mL（總香豆素濃度為2.179 mg/mL），分別調pH為1.5、2.5、3.5、4.5、5.5、6.5、7.5、8.5，加入柱內，以5 BV/h的流速進行吸附，收集吸附后溶液并記錄體積用于測定。

吸取2）、3）、4）中吸附后的溶液適量，按照“1.3.1”的方法于波長322 nm處測定吸光度，然后用50 mL 95%乙醇以2 BV/h的流速進行解吸，收集解吸液并記錄體積，吸取各解吸液適量，按照“1.3.1”的方法測定吸光度，計算吸附率、解吸率。

5） 解吸液乙醇體積分數。取已處理的LX-36型大孔吸附樹脂5份，每份各6 g，濕法上柱，分別加獨活提取液各30 mL（總香豆素濃度為2.165 mg/mL），以5 BV/h的流速進行吸附，收集吸附后溶液并記錄體積，吸取各吸附后的溶液適量，按照“1.3.1”的方法測定吸光度，然后分別加10%、30%、50%、75%、95%乙醇各50 mL以2 BV/h的流速進行解吸，分別收集解吸液并記錄體積，測定吸光度，計算吸附率、解吸率。

6）解吸速率。取已處理的LX-36型大孔吸附樹脂5份，每份各6 g，濕法上柱，分別加入獨活提取液各30 mL（總香豆素濃度為2.168 mg/mL），以5 BV/h的流速進行吸附，收集吸附后溶液并記錄體積，然后加95%乙醇50 mL，分別以1、2、3、4、5 BV/h的流速進行解吸，收集解吸液并記錄體積，測定吸光度，計算吸附率、解吸率。

7）解吸液用量。取已處理的LX-36型大孔吸附樹脂6 g，濕法上柱，加入獨活提取液30 mL（總香豆素濃度為2.180 mg/mL），以5 BV/h的流速進行吸附，收集吸附后溶液并記錄體積，經計算其吸附量為61.53 mg，吸附率為94.08%，然后采用95%乙醇以1 BV/h的流速進行解吸，第1～5個流份為10 mL，第6～14個流份為5 mL收集解吸液，測定其吸光度，計算解吸液中總香豆素的濃度和解吸量。

1.3.6 工藝穩定性驗證 為了考察上述工藝條件的穩定性，進行3次驗證試驗，取已處理的LX-36型大孔吸附樹脂3份，各12 g，濕法上柱，分別加入獨活提取液各60 mL（總香豆素濃度為2.182 mg/mL），以5 BV/h的流速進行吸附，收集吸附后溶液并記錄體積，然后加95%乙醇90 mL，以1 BV/h的流速進行解吸，分別收集解吸液并記錄體積，測定其吸光度，計算吸附率、解吸率。再各取80 mL解吸液、40 mL獨活提取液原液倒入稱重后的蒸發皿中水浴蒸干，然后放入80 ℃的電熱鼓風干燥箱中干燥至恒重，計算浸膏中總香豆素的含量。

2 結果與分析

2.1 樹脂類型的選擇

2.1.1 靜態吸附及解吸 從表1可以看出，綜合6 種大孔樹脂對獨活總香豆素的吸附量、吸附率、解吸量和解吸率可知，LX-36、AB-8、LSA-21 3種樹脂對獨活總香豆素的純化效果相對較好，所以選擇LX-36、AB-8、LSA-21樹脂進行動態研究，以便選擇適合純化獨活總香豆素的最佳樹脂。

2.1.2 動態吸附及解吸 由表2可知，上述3種樹脂對獨活總香豆素的解吸率均高于90%，但LX-36型樹脂的吸附量和解吸量均高于另外2種樹脂，故選擇LX-36型樹脂進行工藝優化的研究。

2.2 LX-36型大孔吸附樹脂工藝優化結果

2.2.1 上樣量 從圖1中可以看出，當吸附后溶液體積為30 mL時，吸附后溶液濃度明顯升高，有大量泄漏。此時，上樣量折合原藥材3 g，因此藥材∶樹脂以1∶2（m∶m，g∶g）較為合適，即上樣量（原藥材）相當于樹脂量的50%。

2.2.2 提取液上樣濃度 由表3可知，除提取液上樣濃度為4.301 0 mg/mL時對獨活總香豆素的吸附率較低外，其他4種上樣濃度的吸附率均高于90.00%，解吸量除上樣濃度為4.301 0 mg/mL時較低外，其他4種上樣濃度的解吸量均高于53.00 mg，綜合吸附量、吸附率、解吸量和解吸率可知，選擇提取液上樣濃度為2.150 5 mg/mL（相當于原生藥濃度0.1 g/mL）為上柱藥液濃度。

2.2.3 上柱吸附速率 由表4可知，上柱吸附速率對獨活總香豆素的吸附率和解吸率影響均較小，不同吸附速率下對獨活總香豆素的吸附率和解吸率差異不大。從節約時間的角度出發，吸附速率選擇以5 BV/h為宜。

2.2.4 提取液pH 由表5可知，提取液pH不同，對樹脂的純化效果有較大的影響，pH為2.5～5.5時對獨活總香豆素的吸附率和解吸率均比較理想。所以選擇提取液pH為4.5左右進行上樣。

2.2.5 解吸液乙醇體積分數 解吸液乙醇的體積分數不同，其極性也不同，對獨活總香豆素的解吸能力也就不同。由表6可知，在其他純化工藝條件固定時，隨著乙醇體積分數的增大，對獨活總香豆素的解吸率逐漸增大，當乙醇濃度為95%時，其解吸率高達90.98%，所以將解吸液乙醇體積分數固定為95%。

2.2.6 解吸速率 由表7可知，解吸速率對獨活總香豆素的解吸率有一定的影響，解吸速率越慢，對獨活總香豆素的解吸效果越好。當解吸速率為1 BV/h時，解吸率達到93.47%，所以確定最佳解吸速率為1 BV/h。

2.2.7 解吸液用量 由圖2可知，當解吸液用量為95 mL時，解吸液中總香豆素的解吸量為58.25 mg，其解吸率為94.67%，當解吸液用量為40 mL時，總香豆素的解吸量為55.45 mg，占總解吸量的95.19%，當解吸液用量為50 mL時，總香豆素的解吸量為57.14 mg，占總解吸量的98.09%，從節約乙醇用量的角度出發，解吸液用量選擇45 mL左右時即可將獨活總香豆素解吸完全。

2.3 LX-36型大孔吸附樹脂純化獨活總香豆素工藝穩定性驗證

由以上結果可知，采用LX-36型大孔吸附樹脂純化獨活總香豆素的較佳工藝為：提取液上樣量為藥材∶樹脂1∶2，提取液上樣濃度相當于原藥液濃度0.1 g/mL，提取液pH為4.5，上樣吸附速率為5 BV/h，解吸液乙醇體積分數95%，解吸速率為1 BV/h，解吸液用量為45 mL左右。通過3次工藝穩定性驗證試驗，得到干浸膏中總香豆素含量分別為27.07%、26.97%、27.23%，平均為27.09%。可以看出，經LX-36型大孔吸附樹脂處理獨活提取液后，干膏中總香豆素含量可由8.42%提高到27.09%（表8）。

3 結論

采用6種不同型號的大孔吸附樹脂對獨活總香豆素的純化工藝進行了試驗，通過對影響大孔吸附樹脂吸附及解吸的各種因素的研究，確定了LX-36型大孔吸附樹脂分離純化獨活總香豆素的效果相對比較理想，其純化工藝條件為獨活提取液上樣量為藥材∶樹脂1∶2，提取液上柱濃度相當于原藥濃度0.1 g/mL，提取液pH為4.5，上樣吸附速率為5 BV/h，再用5倍柱體積的95%乙醇以1 BV/h的流速進行解吸，解吸率可以高達92.73%，純化后的干浸膏中總香豆素的含量由原來的8.42%升高到27.09%，表明LX-36型大孔樹脂對獨活總香豆素具有一定的純化性能，為獨活的進一步開發利用提供了基本依據。

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3 結論

采用6種不同型號的大孔吸附樹脂對獨活總香豆素的純化工藝進行了試驗，通過對影響大孔吸附樹脂吸附及解吸的各種因素的研究，確定了LX-36型大孔吸附樹脂分離純化獨活總香豆素的效果相對比較理想，其純化工藝條件為獨活提取液上樣量為藥材∶樹脂1∶2，提取液上柱濃度相當于原藥濃度0.1 g/mL，提取液pH為4.5，上樣吸附速率為5 BV/h，再用5倍柱體積的95%乙醇以1 BV/h的流速進行解吸，解吸率可以高達92.73%，純化后的干浸膏中總香豆素的含量由原來的8.42%升高到27.09%，表明LX-36型大孔樹脂對獨活總香豆素具有一定的純化性能，為獨活的進一步開發利用提供了基本依據。

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3 結論

采用6種不同型號的大孔吸附樹脂對獨活總香豆素的純化工藝進行了試驗，通過對影響大孔吸附樹脂吸附及解吸的各種因素的研究，確定了LX-36型大孔吸附樹脂分離純化獨活總香豆素的效果相對比較理想，其純化工藝條件為獨活提取液上樣量為藥材∶樹脂1∶2，提取液上柱濃度相當于原藥濃度0.1 g/mL，提取液pH為4.5，上樣吸附速率為5 BV/h，再用5倍柱體積的95%乙醇以1 BV/h的流速進行解吸，解吸率可以高達92.73%，純化后的干浸膏中總香豆素的含量由原來的8.42%升高到27.09%，表明LX-36型大孔樹脂對獨活總香豆素具有一定的純化性能，為獨活的進一步開發利用提供了基本依據。

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