豬流行性腹瀉預防及診斷研究進展

張冰　關增春　于曉娜　劉學

摘要：豬流行性腹瀉是由豬流行性腹瀉病毒（PEDV）引起的豬的一種高度接觸性腸道傳染病，近幾年PED的流行特點和發病情況發生很大的變化，給防治工作帶來了許多困難，對養豬業造成巨大的經濟損失。本文從豬流行性腹瀉的疫苗免疫和實驗室診斷兩個方面進行綜述，為豬流行性腹瀉的防控提供參考。

關鍵詞：豬流行性腹瀉；疫苗免疫；實驗室診斷

中圖分類號：S858.31 文獻標識碼：B 文章編號：1007-273X（2014）09-0084-03

豬流行性腹瀉（porcine epidemic diarrhea PED）是由豬流行性腹瀉病毒（PEDV）引起的豬的一種高度接觸性腸道傳染病，以嘔吐、腹瀉和食欲下降為基本特征。各種年齡的豬均易感[1]，但對哺乳仔豬、架子豬或育肥豬的危害更大，尤其是哺乳仔豬危害最為嚴重。該病自1971年在英國首先報道了PEDV的發生，相繼在比利時、德國、瑞士、日本等許多國家報道了本病的發生[2]。1973年，類豬傳染性胃腸炎的急性腹瀉首先在我國上海發生，但是直到1984年，才經熒光抗體試驗和血清中和試驗證實該病的病原是PEDV[3]。到目前為止，我國已有24個省報道了PED的發生和流行情況[4]。PED主要發生在冬春季節，病毒主要通過感染豬的糞便而傳播，自然感染病例大多是經口攝入而感染，糞—口途徑是該病的主要傳播途徑[5]。PEDV感染2周齡仔豬引起嘔吐、腹瀉、脫水為特征的急性腸道傳染病，死亡率高達100%，對世界范圍內的養豬業均造成極大的威脅。隨著如今集約化、規?；B殖的發展，給該病的傳播創造了有利條件。疫苗免疫是豬流行性腹瀉免疫預防的主要手段，而由于該病的流行病學和臨床癥狀方面與豬傳染性胃腸炎無顯著差別，因此必須借助于實驗室檢查方法才能確診。本文從該病疫苗預防和實驗室診斷兩方面介紹豬流行性腹瀉的預防和診斷的研究情況。

1 PED疫苗的研究

1.1 PED組織滅活苗

PEDV的滬毒株（S株）接種3～9日齡仔豬，待典型發病后采集病豬小腸組織及內容物，制備PED氫氧化鋁滅活苗，該疫苗經后海穴注射，對仔豬的主動保護率為85%，被動保護率為97.06%。接種后2周開始產生免疫力，免疫期可達6個月[6]。

1.2 PED細胞滅活苗

由于組織滅活苗存在操作繁瑣、生產成本高及質量難以控制等缺點，因此采用在病毒培養液中加適量胰酶的培養方法，將PEDV CV777適應于Vero細胞，以2代毒制備氫氧化鋁滅活苗，后海穴接種對仔豬的主動免疫保護率為85.19%被動免疫保護率為85%[7]。通過該方法制備的PED細胞滅活苗可用于現在PEDV的預防與控制。

滅活疫苗具有安全、穩定的優點，但同時具有需要大劑量接種或者應用濃縮抗原；免疫期短常需強化接種；不能引起局部免疫，以致細胞免疫的作用弱；產生完全免疫力需要2周；不利于緊急預防接種與降低疫苗費用等缺點。

1.3 PED弱毒苗

目前，PED的商品化弱毒疫苗主要有我國的CV777株，日本的P-5V株和韓國的KPED-9株、DR13株。中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所研究將適應Vero細胞的CV777株從90代起進行克隆純化，克隆后的弱毒株仍保持良好的安全性，主動免疫與被動免疫的保護率分別達到95.92%及96.2%。穩定性試驗經6代次的返祖傳代仍是穩定的，未見毒力返強[8]。日本的P-5V株雖然沒有連續傳代致弱的相關報道，卻在日本和韓國用于PED的預防。韓國的KPED-9是由從新生仔豬分離的KPEDV-9通過Vero細胞連續傳代93代后制備而成的；DR13是由從患病仔豬小腸內容物分離的DR13強毒通過Vero細胞連續傳代而成，該疫苗是韓國用于預防PED的口服疫苗。

1.4 轉基因植物疫苗

轉基因植物作為口服疫苗有可能產生理想的黏膜免疫反應，從而達到預防病毒性腹瀉病的目的。Yang等[9]將PEDV的S基因轉入煙草中，提取轉基因植物蛋白給小鼠注射，證明其具有免疫原性。給小鼠飼喂這種轉基因植物可誘導小鼠產生全身免疫和黏膜免疫。Yang等[10]相繼應用膿桿菌介導的蛋白轉入法將PEDV的S基因的主要抗原位點（命名為K-COE）和合成的PEDV中和抗原表位在煙草中表達。這些研究為研制PEDV口服轉基因植物疫苗提供了新的思路。目前，在以煙草花葉病毒為載體的無煙堿煙草植物中PEDV的S蛋白中和表位得到了成功表達，用表達蛋白免疫接種后，對仔豬具有良好的保護作用，為PEDV轉基因植物疫苗的研究奠定了基礎。植物的多種優越性均可被用于研究轉基因疫苗，并且已經取得了很大的進展。但仍有一些障礙必須克服，如蛋白在植物中的表達水平低、表達產物在植物中的穩定性差、轉基因口服疫苗在產生免疫反應之前在胃腸道內有時被消化等[11]，科學家就這些問題進行了研究并正在加以解決。

1.5 多價聯合疫苗

1.5.1 TGEV與PEDV二聯疫苗 目前，在我國用于PED預防和控制的疫苗主要是PED-TGE二聯苗。由于PEDV和TGEV均屬于冠狀病毒，而且致病機理相似，組織嗜性相同。因此，研制聯苗亦是可行的。二聯疫苗的特點是：毒價高，后海穴接種，增強了免疫保護力，一次接種即可，省時、省力，且保護率高。

1.5.2 EDV、TGEV、RV三聯滅活苗 上海農科院畜牧獸醫研究所錢永清等[12]采用豬流行性腹瀉病毒（PEDV）、豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）和豬輪狀病毒（RV）細胞培養物制備了三聯滅活疫苗。實驗室免疫結果表明，妊娠母豬和育肥豬免疫后15 d達到較高的免疫水平，免疫有效期超過6個月，妊娠母豬所產仔豬可獲得高水平的被動免疫保護。試驗場應用結果表明，母豬保護率達98%，仔豬被動免疫保護率達93%。

1.6 展望

隨著分子生物學的發展，20世紀90年代初基因疫苗得到了發展。與傳統的弱毒或滅活疫苗相比，DNA疫苗具有不散毒、不返強的優點。此外乳酸桿菌作為微生態制劑中的主要益生菌，廣泛應用于食品、飼料加工業。構建乳酸桿菌質粒載體，表達在黏膜系統中增殖的病原微生物的保護性抗原基因，制備綠色環保、可食用的多功能黏膜免疫的微生態制劑疫苗應用前景廣闊。而黏膜免疫恰恰是防治TGE和PED的主要途徑。因此未來基因疫苗和微生態制劑對豬流行性腹瀉的預防上有著很好的發展前景。

2 PED的實驗室診斷

2.1 病毒的分離鑒定

有研究表明，用含有60 μg/mL胰酶液的細胞培養液中進行PEDV傳代適應，在第3代就出現明顯的CPE，第5代毒價可達10～7.0/0.1 mL，并通過乳豬回歸試驗和特異性中和試驗證實所增殖的病毒為豬流行性腹瀉病毒[13]。這些病毒分離鑒定的方法對PED血清學、病原學、免疫學等方面的研究提供了一個良好的技術平臺，但由于病毒的分離鑒定需要有一套成熟的細胞培養體系，而且PEDV需要在細胞系中連續傳代才能出現明顯的CPE，目前尚無法推廣應用。

2.2 微量血清中和試驗

林志雄等[14]利用已適應于傳代細胞生長的豬流行性腹瀉病毒PEDV-G1株，以PK-15作指示細胞，與被檢血清進行微量中和，測定待檢血清中的特異性抗體，48 h進行結果判定，證實該方法可以用來檢測豬流行性腹瀉病毒，而且檢測結果準確、可靠，具有較高的敏感性，可用于大規模的流行病學調查，并建立了PED微量血清中和試驗。但該方法需要標準毒株作為指示毒株和成熟的細胞培養體系，實驗條件的限制因素比較多，很難在短期內應用于臨床實踐。

2.3 免疫電鏡法（IEM）

該方法簡便、直觀、快速、定性準確，但該方法要求有價格高昂的電鏡設備，而且電鏡檢查一般需3～7 d才能出報告，不適用于大規模臨床診斷[15]。

2.4 免疫熒光法

試驗研究證明，用直接免疫熒光法（FAT）檢查病料中的豬流行性腹瀉抗原是可靠的特異性診斷方法，目前應用最為廣泛。崔現蘭等對免疫熒光法用于豬流行性腹瀉的診斷進行了大量的探索，結果表明：FAT的檢出率為91.4%，間接免疫熒光法（IFAT）的檢出率為89%，而且比電鏡更敏感、更可靠。由于該方法需要在病死豬只或在腹瀉早期撲殺后取腸道組織制備切片，故很難用于臨床診斷。

2.5 酶聯免疫吸附試驗（ELISA）

ELISA試驗可直接應用于糞便中PEDV的檢測，而且比電鏡更敏感可靠，應用較為廣泛。韓國學者Kim O等建立了可在福爾馬林固定、石蠟包埋的腸組織中準確而特異的檢出PEDV的單克隆抗體基礎上的免疫組化法，該方法也可用于鑒別診斷PEDV與TGEV。但該方法對病料的前期處理比較繁瑣。

2.6 反轉錄—聚合酶鏈式反應（RT-PCR）

近年來，隨著分子生物學的發展，對于PEDV和TGEV核酸的檢測方法越來越受到人們的重視。有研究表明，RT-PCR法是目前鑒別診斷TGEV和PEDV最敏感、特異的方法。傳統方法診斷主要從病毒的分離與鑒定、抗原檢測、電鏡檢測、血清學診斷等方面進行。與傳統方法比較，RT-PCR方法只需要病豬的糞便即可進行活體診斷，便于疾病的早期診斷，敏感性和特異性高，而且操作步驟更加快速、方便，一般4～6 h內可以提供準確的結果。

2.7 展望

傳統的PEDV診斷方法最常用的是病毒分離，但耗費時間長，往往使防治錯過了最佳時機。近年來發展的PCR技術有效地解決了這些不足，但是普通RT-PCR在定量研究上仍不能盡如人意。SYBR GreenⅠ熒光染料定量PCR技術是在反應管中加入熒光染料，這種染料可嵌入雙鏈DNA，并且只有在嵌入到DNA后才能被激發產生熒光。隨著擴增反應的延伸，熒光信號會因為DNA產物的增加而增加，因此SYBR GreenⅠ熒光信號的積累與擴增出的雙鏈DNA的數量成正相關。該方法具有操作簡便，敏感性高，重復性好，污染少，用時短和可自動定量分析等優點，已成為病原檢測的重要方法。該方法也為建立區分PEDV強弱毒的熒光定量PCR方法、鑒別診斷PEDV與TGEV的熒光定量PCR方法及多重復合熒光定量PCR方法奠定了重要基礎。

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