熱變性對外周血細胞亞群標記效果的影響

馬曉彩 孫雪靜 王胤穎 劉聰艷 萬歲桂 蘇 力 孫婉玲

(首都醫科大學宣武醫院血液科，北京100053)

流式-熒光原位雜交(flow cytometry-fluorescence in situ hybridization，Flow-FISH)技術是將流式細胞術和熒光原位雜交技術相結合的一種實驗方法，可以用于血細胞不同亞群相對端粒長度的檢測［1-2］。由于Flow-FISH操作過程中，需要通過高溫使檢測細胞內的核酸解鏈，即熱變性，才能與標記熒光的核酸探針雜交結合，因此熱變性對于流式細胞術分析結果至關重要。在既往的研究［3-4］中，筆者研究了熱變性對血細胞的散射光信號、CD45熒光信號的影響［3］，也初步探索了通過標記CD34+細胞的Flow-FISH技術檢測CD34+細胞相對端粒長度的實驗過程［4］。

為了進一步觀察熱變性對其他血細胞亞群標記效果的影響、確定 Bis［sulfosuccinimidyl］suberate(BS3)交聯劑的有效濃度，本研究模擬了Flow-FISH流程對外周血細胞進行了熱變性，通過流式細胞術觀察熱變性前后細胞亞群的標記效果，從而建立穩定的Flow-FISH技術流程。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

Telomere PNA Kit/FITC for Flow Cytometry試劑盒購自丹麥 Dako公司;Alexa Fluor?647標記的 CD3、CD19、CD14抗體均購自美國BioLegend公司;交聯劑Bis(Sulfosuccinimidyl)Suberate(BS3)購自美國Pierce公司。FACS Calibur流式細胞儀為美國Becton Dickinson公司產品。

1.2 標本采集

采集10例健康人肝素抗凝外周血8 mL，氯化銨裂解紅細胞法獲得外周血有核細胞，PBS洗滌并調整細胞濃度為2×106/mL。

1.3 Alexa Fluor?647標記抗體耐熱性檢測

1.3.1 抗體標記

外周血有核細胞設6管，分為3組，每組均包括常規管和熱變性管，每管含2×106個細胞。3組細胞分別加入 Fluor?647-CD3、CD19、CD14 抗體5 μL，室溫避光孵育20 min，PBS洗滌、離心棄上清;常規管加入1%多聚甲醛500 μL，混勻后待第2日流式細胞術檢測。

1.3.2 抗原抗體信號固定

熱變性管中加入320 μL PBS及12.5 mmol/L BS3交聯劑80 μL(BS3終濃度2.5 mmol/L)，避光孵育 30 min。加入 1 mol/L Tris·Hcl(pH 7.5)8 μL，避光孵育15 min。PBS洗2遍、離心棄上清。加入PBS 500 μL 后混勻。

1.3.3 加熱變性

熱變性管細胞置于82℃水浴變性10 min，室溫避光過夜后流式細胞術檢測。1.3.4 流式細胞術檢測

②河道水環境沒有得到根本改變。農村生活污水直排入河內狀況還未改觀，農業面源污染無法有效控制，工業廢水不達標排放，農村生產、生活污水處理還處于起步階段，農村河道水質惡化，水環境狀況不容樂觀。

常規管與熱變性管同時檢測，流式細胞儀收集各管細胞條件保持恒定，每管收集50 000個細胞。將Alexa Fluor?647熒光設定在FL4通道上。前向散射光(forward light scatter，FSC)、側向散射光(sideward light scatter，SSC)信號采用線性坐標，Alexa Fluor?647熒光信號采用對數坐標。結果以CellQuest軟件分析。

1.4 BS3有效濃度的探索

1.4.1 抗體標記

外周血有核細胞設4管，標記為管1～管4，每管含2×106個細胞。4管細胞均加入Fluor?647-CD3抗體5 μL，室溫避光孵育 20 min，PBS 洗滌、離心棄上清。

1.4.2 抗原抗體信號固定

4管細胞均加入300 μL PBS、混勻，分別向管1～管4逐滴加入濃度為12.5 mmol/L的 BS3交聯劑75 μL、117 μL、169 μL 和 200 μL，使 BS3終濃度分別為 2.5 mmol/L、3.5 mmol/L、4.5 mmol/L 和5 mmol/L，避光孵育30 min。分別加入1 mol/L Tris·Hcl 7.6 μL、8.5 μL、9.6 μL 和 10.2 μL，使其終濃度為20 mmol/L，避光孵育15 min。PBS洗2遍、離心棄上清。加入PBS 500 μL后混勻。

1.4.3 加熱變性及流式細胞術檢測

2 結果

2.1 Alexa Fluor?647標記抗體的耐熱性

在 Alexa Fluor?647-CD3、CD19、CD14 與 SSC 設門的散點圖中，常規管中細胞均可以清晰的顯示出目標細胞群，即T淋巴細胞群(CD3+)(圖1A)、B淋巴細胞群(CD19+)(圖1B)和單核細胞群(CD14+)(圖1C)。經過熱變性的細胞，雖然CD3和CD19的熒光強度較常規管有所減弱，但均可將T淋巴細胞群(圖1D)和B淋巴細胞群(圖1E)清晰顯示;而CD14的熒光強度與常規管無變化，單核細胞群清晰可辨(圖1F)。

2.2 BS3的有效濃度

在Alexa Fluor?647-CD3與SSC設門的散點圖中，BS3終濃度分別為 2.5 mmol/L、3.5 mmol/L、4.5 mmol/L和5 mmol/L的4管外周血細胞中，CD3的標記效果基本一致，即抗原抗體標記效果不隨交聯劑BS3濃度的增大而提高(圖2)。因此終濃度2.5 mmol/L的BS3，既保證交聯效果、又不影響雜交效果，是理想的作用濃度。

3 討論

流式-熒光原位雜交技術結合了流式細胞術的高通量和熒光原位雜交技術的高敏感性的優勢，能夠根據不同細胞群在流式細胞術中的不同特點選定目的細胞，進而進行細胞遺傳學分析，特別適用于細胞數少、不適合進行分選的標本，例如骨髓和外周血標本［5-7］。然而原位雜交過程中的熱變性步驟會對不同細胞群產生不同的影響，包括使細胞物理特性變化、熒光淬滅、抗原抗體結合不穩定［8］，從而影響流式細胞術對不同細胞群的區分［9］，因此了解高溫對細胞特性的影響、耐熱熒光的應用及交聯劑的應用，均為保證Flow-FISH有效檢測的必要條件。

圖1 Alexa Fluor?647標記抗體耐熱性Fig.1 The thermal stability of antibodies labeled with Alexa Fluor? 647

圖2 不同終濃度BS3對CD3表達的影響Fig.2 The effect of different concentration BS3on the expression of CD3

筆者前期的研究［3］工作發現，熱變性會使血細胞在流式細胞術中的散射光信號發生變化，通過散射光設門無法有效區分出各細胞亞群;熱變性也會使血細胞CD45表達減弱，通過CD45和側向散射光設門也不能將各群細胞精確區分。而且通過耐熱熒光染料Alexa Fluor?647標記的抗CD34抗體及交聯劑BS3的應用，可以保證熱變性后熒光質量、抗原抗體有效結合，從而對CD34+細胞進行相關分析［4］。同時內對照細胞遺傳學特性的穩定性也能夠保證不同實驗批次結果的可比性［10］。因此通過系列特異性抗原的標記區分不同細胞亞群的可行性，是進一步開展Flow-FISH分析細胞亞群遺傳學特性的必要前提。

本研究的結果顯示，與未熱變性的細胞相比，通過Alexa Fluor?647標記的抗 CD3、CD19和 CD14抗體對外周血細胞進行標記并高溫變性后，T淋巴細胞表達CD3和B淋巴細胞表達CD19的熒光強度均明顯減弱，且粒細胞發生脫顆粒導致側向散射光減弱，從而使T淋巴細胞和B淋巴細胞在散點圖中的位置發生了變化，但是仍可以根據細胞的相對位置清晰的對這兩群細胞進行設門，進而達到針對細胞亞群分析的目的。同樣的熱變性處理對單核細胞表達Alexa Fluor?647-CD14的熒光強度沒有影響，提示CD14抗原的耐熱性優于CD3和CD19，對單核細胞采用Flow-FISH技術進行分析更為易行。根據上述結果及其他學者類似的研究結果［2］，筆者推測，抗原抗體熒光信號的耐熱性不僅與熒光染料有關，還與抗原本身的特性有關。這也許是CD45經高溫變性后不能有效區分細胞亞群的原因之一。

熱變性除了會使熒光信號發生變化，還會破壞細胞表面抗原與抗體的結合，同時在雜交過程中應用的甲醛等固定劑也會影響抗原抗體結合，從而導致細胞亞群分析失敗，因此交聯劑BS3的應用在Flow-FISH中是必需的。在實施過程中，過高濃度的交聯劑會影響原位雜交效果、增加實驗成本，過低濃度則會導致抗原抗體結合效率低，因此探索有效適宜的BS3濃度也是保證實驗順利進行的必要過程。根據本研究的結果，高于2.5 mmol/L濃度的BS3并沒有帶來更高的結合效果，因此2.5 mmol/L是BS3的適宜濃度。

通過以上研究結果，筆者推斷，在Flow-FISH應用的過程中，通過耐熱熒光染料標記的細胞系列特異性抗體對骨髓或外周血標本進行標記、并以適宜濃度交聯劑作用后，可以有效區分標本中不同的細胞亞群并進行相關分析。

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