α-突觸核蛋白寡聚體抑制大鼠原代培養(yǎng)神經(jīng)元突起早期生長

王 鵬 李 昕 陳予東 楊巍巍 李旭冉 于 順*

(1.首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院神經(jīng)生物學(xué)研究室，北京100053;2北華大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)教研室，吉林吉林132013)

帕金森病(Parkinson's disease，PD)是臨床上最常見的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病之一，表現(xiàn)呈進展性，目前臨床上尚無控制病程發(fā)展的有效措施，因此揭示這一疾病的機制，采取早期診斷并預(yù)防顯得日益迫切。PD的病理特征為黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元發(fā)生變性壞死，以及路易小體(Lewy body)和路易軸索(Lewy neurite)的形成［1-2］。Lewy body和Lewy neurite是纖維淀粉樣變的嗜酸性包涵體。人α-突觸核蛋白(α-synuclein，α-Syn)是參與形成淀粉樣變性的主要成分。已知，LB的主要成分是聚集的α-突觸核蛋白(α-synuclein，α-Syn)［3-6］，聚集成寡聚體的 α-Syn對神經(jīng)元具有毒性作用［7-8］。α-Syn 主要分布于突觸前膜和核膜［9-11］，與細胞的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)，參與突觸形成、維持和神經(jīng)元的分化。近來研究［12］表明α-Syn與微管蛋白互為分子伴侶，通過促進微管蛋白的聚合，α-Syn能夠加速微管的形成。本課題組進一步發(fā)現(xiàn)α-Syn可以促進原代培養(yǎng)的大鼠原代神經(jīng)元和MES23.5細胞的突起生長［13］，該功能片段位于蛋白的NAC段和C端，其家族型突變體A53T、A30P沒有突起促生長功能［14］。這些發(fā)現(xiàn)提示α-Syn的突起促生長功能改變及其潛在的對突觸可塑性影響可能是PD發(fā)病早期的重要線索。本研究的目的是探討α-Syn的寡聚體對神經(jīng)元突起生長的影響，為揭示PD發(fā)病中Lewy小體形成及其發(fā)病機制提供線索。

1 材料和方法

1.1 主要試劑

BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒，購自Pierce Biotech公司;α-Syn單克隆抗體3D5，由首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院神經(jīng)生物研究室制備;FITC標(biāo)記的羊抗鼠抗體，購自中衫金橋公司;細胞培養(yǎng)基neurobasal和胎牛血清(FBS)購自美國Gibco公司;蛋白相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，購自美國Pharmacia公司。其他均為化學(xué)分析純試劑。

1.2 實驗動物

新生24 h Wistar大鼠32只，雌雄不限，購自中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心［實驗動物許可證號:SCXK-(軍)2002-001］。

1.3 實驗方法

1.3.1 α-Syn重組蛋白的制備與純化

將人α-Syn cDNA分別插入表達載體pET(3a)，然后轉(zhuǎn)化至BL21(DE3)感受態(tài)細胞，在含氨芐西林的YTA培養(yǎng)液中培養(yǎng)，以異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside，IPTG)誘導(dǎo)重組蛋白表達。所表達的基因重組型蛋白采用離子交換層析和反向?qū)游龇兓⒓兓蟮牡鞍淄肝觯盅b，冷凍抽干。純化后的蛋白用SDS-PAGE法和Western blotting法鑒定，BCA法定量。

1.3.2 α-Syn寡聚體標(biāo)準(zhǔn)品的制備

將α-Syn凍干粉末用PBS溶解使其終質(zhì)量濃度為100 μmol/L，經(jīng)0.22 μm 濾膜過濾除菌，在37 ℃下650 r/min恒溫振蕩72 h。

1.3.3 α-Syn寡聚體的測定

參照作者實驗室已建立的方法［15］進行測試。用濃度為1 mg/L 3D5包被96孔酶標(biāo)板，2.5% 明膠封閉2 h。加入寡聚體樣品，37℃孵育2 h，再加入終濃度為1 mg/L生物素標(biāo)記3D5抗體，37℃孵育2 h。洗板后向各孔加入1/5 000稀釋的堿性磷酸酶標(biāo)記的親和素，37℃孵育后以對硝基酚磷酸(Disodium 4-nitrophenyl phosphate，pNPP)顯色液顯色，于波長405 nm處測定吸光度值。

1.3.4 原代神經(jīng)元培養(yǎng)

將新生24 h大鼠斷頭取腦，置于D-Hank's緩沖液。剝?nèi)パ苣X膜，分離皮質(zhì)，剪碎。胰酶消化30 min后吹散，200目篩網(wǎng)過濾。800 r/min離心2 min。棄上清，沉淀以DMEM培養(yǎng)基懸浮并計數(shù)細胞。以0.75×105個/皿接種在用多聚賴氨酸包被好的培養(yǎng)皿(φ35 mm)中，加入相應(yīng)蛋白進行分組培養(yǎng)。

1.3.5 神經(jīng)元突起生長觀察和長度測量

培養(yǎng)至第1、2和4小時，以多聚甲醛室溫下固定1 h。隨機挑選20個視野進行觀察，每個視野至少有5個存活的神經(jīng)元［16］。應(yīng)用Image-Pro Plus V2.0軟件測量神經(jīng)元突起的長度。

1.3.6 Western blotting法和免疫熒光法鑒定轉(zhuǎn)入細胞內(nèi)α-Syn寡聚體

吸棄培養(yǎng)基，PBS沖洗。刮下細胞，超聲破碎。功率200 W，30 s 2次，間歇30 s。破碎后的細胞溶液加入SDS-PAGE Running Buffer，沸水中煮5 min。離心并轉(zhuǎn)移上清，取30 μL作為樣品，進行SDS-PAGE。電泳結(jié)束后轉(zhuǎn)PVDF膜、封閉。沖洗后，以1/1 000比例稀釋的3D5抗體反應(yīng)過夜。洗膜，再與1/5 000稀釋的生物素標(biāo)記的羊抗鼠抗體溶液反應(yīng)。ECL法顯示條帶。

將培養(yǎng)細胞，以1%的戊二醛室溫下固定1 h后，PBS沖洗培養(yǎng)皿。以含10%羊血清的PBST溶液，室溫封閉1 h。棄封閉液，加入1/5 000稀釋的3D5抗體1.5 mL，4℃過夜。PBST沖洗后加入1/500稀釋的FITC標(biāo)記羊抗鼠抗體，37℃，2 h;吸棄反應(yīng)液，PBST沖洗。熒光顯微鏡下觀察照相。

1.3.7 培養(yǎng)分組方案

向原代神經(jīng)元培養(yǎng)基中添加終濃度為10 μmol/L的α-Syn寡聚體，培養(yǎng)至第1、2、4小時觀察。分別添加終濃度為 1、5、10、15 和 20 μmol/L 的相應(yīng)蛋白，培養(yǎng)至4 h，觀察突起長度變化。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 17.0軟件，數(shù)據(jù)均進行正態(tài)性檢驗，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示。兩組間比較采用t檢驗。多組樣本均數(shù)比較采用析因方差分析法。兩變量的相關(guān)分析采用Bivariate過程的Pearson直線相關(guān)法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 重組蛋白純化鑒定結(jié)果

經(jīng)SDS-PAGE和Western blotting法鑒定，獲取的α-Syn和寡聚體純度較高，根據(jù)分子量判斷圖1。

2.2 α-Syn寡聚體對神經(jīng)元突起生長有抑制作用

添加α-Syn寡聚體(10 μmol/L)以及其他蛋白進行分組培養(yǎng)。經(jīng)觀察，在神經(jīng)細胞生長早期，各組間細胞的形態(tài)和數(shù)量并無差異。細胞培養(yǎng)至1、2 h，添加α-Syn寡聚體組的神經(jīng)元突起平均長度小于對照組(P＜0.05)。培養(yǎng)至4 h，α-Syn寡聚體組神經(jīng)元突起長度明顯小于對照組(P＜0.01)，詳見圖2。添加不同濃度(1～20 μmol/L)的各蛋白，培養(yǎng)至4 h觀察，α-Syn寡聚體組突起長度隨寡聚體濃度的增加而生長的趨勢減小，對照組則無變化，詳見圖3。可見α-Syn寡聚體可以抑制神經(jīng)元突起生長。

圖1 α-Syn的純化及鑒定Fig.1 Puritication and identification of α-Syn

圖2 α-Syn寡聚體對神經(jīng)元突起早期生長的影響Fig.2 The α-Syn oligomer inhibits on the neurite outgrowth

圖3 α-Syn寡聚體對神經(jīng)元突起生長的抑制作用具有劑量效應(yīng)關(guān)系Fig 3.The effect of α-Syn oligomer inhibit on the neurite outgrowth appeared dose-effect dependent relation

2.3 α-Syn寡聚體可以從培養(yǎng)基進入神經(jīng)元內(nèi)

添加α-Syn寡聚體組神經(jīng)細胞裂解液Western blotting法檢測結(jié)果現(xiàn)清晰條帶，對照組為陰性，圖4A。免疫熒光實驗結(jié)果顯示神經(jīng)元顯色清晰，在胞漿內(nèi)廣泛分布并呈現(xiàn)顆粒狀，α-Syn組在胞質(zhì)內(nèi)均勻分布，而對照組為陰性，見圖4B。可見α-Syn寡聚體可以從培養(yǎng)基進入神經(jīng)元并影響突起生長。

3 討論

圖4 α-Syn寡聚體向細胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運Fig.4 Transportation of α-Syn oligomer into primarily cultured neurons

在原代神經(jīng)元生長初期，微管(microtubule)在神經(jīng)細胞的突起中起細胞骨架的作用，輔助突起發(fā)育。在成熟的神經(jīng)元中，微管是物質(zhì)運輸?shù)耐緩剑瑓⑴c神經(jīng)遞質(zhì)的傳遞。體外研究［17］證明，α-Syn具有與tau蛋白相似的作用，可以促進微管蛋白組裝成微管。本課題組前期研究［18-20］發(fā)現(xiàn)通過促進微管的組裝，α-Syn可以促進大鼠原代神經(jīng)元突起的生長，這一作用提示該蛋白很可能參與神經(jīng)系統(tǒng)早期發(fā)育階段神經(jīng)元突起的形成以及中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后的修復(fù)。而在帕金森病的發(fā)病過程中，α-Syn異常聚集形成寡聚體。患者血液、腦脊液中亦可檢測到主要成分為聚集的α-Syn的Lewy小體，由此可知致PD患者神經(jīng)元死亡的內(nèi)環(huán)境紊亂可能是由于α-Syn寡聚體的存在。本實驗結(jié)果證實α-Syn的寡聚體可以進入原代神經(jīng)元細胞內(nèi)，并抑制突起的早期生長。這一結(jié)果的原因可能由于伴侶蛋白的異常聚集或寡聚體的直接干擾，影響微管的合成和有序排列，致使神經(jīng)元突起修復(fù)和重建障礙或軸漿轉(zhuǎn)運紊亂，導(dǎo)致細胞間或細胞內(nèi)無定形物的形成聚集。促微管聚合的作用的喪失，可能影響神經(jīng)系統(tǒng)的早期發(fā)育以及中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后的修復(fù)，對揭示α-Syn突變導(dǎo)致神經(jīng)元退變的機制也有重要意義。

本研究結(jié)果顯示，在原代神經(jīng)元培養(yǎng)早期，外源性的α-Syn寡聚體可抑制突起生長。Sung等［21］實驗發(fā)現(xiàn)α-Syn抑制H19-7大鼠海馬神經(jīng)祖細胞的增生。Western blotting法檢測結(jié)果顯示添加α-Syn寡聚體組細胞內(nèi)蛋白免疫反應(yīng)呈陽性，進入細胞的寡聚體以二聚體和三聚體為主，對照組為陰性。免疫熒光印跡結(jié)果顯示，α-Syn組和寡聚體組在神經(jīng)元內(nèi)呈現(xiàn)輪廓清晰的綠色熒光，證明外源性的α-Syn和寡聚體在胞體和突起均有分布。外源性α-Syn進入神經(jīng)元內(nèi)，分布均勻。這與微管在細胞內(nèi)的分布一致，提示進入細胞的α-Syn與微管蛋白之間存在伴侶關(guān)系。而寡聚體則呈現(xiàn)顆粒狀分布，可能與其抑制微管蛋白聚合形成微管這一作用有關(guān)［22］。雖然α-Syn寡聚體的細胞毒性已作為PD研究的熱點多時，但寡聚體的形成原因與機制仍未完全明確。本研究從α-Syn寡聚體與微管蛋白之間的共同作用關(guān)系入手，成為解釋PD病因的新的觀點。此研究結(jié)果為揭示α-Syn的功能，及其與微管蛋白的關(guān)系提供了新證據(jù)，對PD的病因、病機闡述提供了新思路。

［1］ Alberio T，F(xiàn)asano M.Proteomics in Parkinson's disease:An unbiased approach towards peripheral biomarkers and new therapies［J］.J Biotechnol，2010，156(4):325-337.

［2］ Spillantini M G，Crowther R A，Jakes R，et al.alpha-Synuclein in filamentous inclusions of Lewy bodies from Parkinson's disease and dementia with lewy bodies［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，1998，95(11):6469-6473.

［3］ Spillantini M G，Schmidt M L，Lee V M，et al.Alpha-synuclein in Lewy bodies［J］.Nature，1997，388(6645):839-840.

［4］ Baba M，Nakajo S，Tu P H，et al.Aggregation of alphasynuclein in Lewy bodies of sporadic Parkinson's disease and dementia with Lewy bodies［J］.Am J Pathol，1998，152(4):879-884.

［5］ Ferrer I，Martinez A，Blanco R，et al.Neuropathology of sporadic Parkinson disease before the appearance of parkinsonism:preclinical Parkinson's disease ［J］.J Neural Transm，2011，118(5):821-839.

［6］ Sulzer D，Surmeier D J.Neuronal vulnerability，pathogenesis，and Parkinson's disease ［J］.Mov Disord，2013，28(6):41-50.

［7］ Kalia L V，Kalia S K，McLean P J，et al. α-Synuclein oligomers and clinical implications for Parkinson disease［J］.Ann Neurol，2013，73(2):155-169.

［8］ Danzer K M，McLean P J.Drug targets from genetics:alpha-synuclein ［J］.CNS Neurol Disord Drug Targets，2011，10(6):712-723.

［9］ Maroteaux L，Campanelli J T，Scheller R H.Synuclein:a neuron-specific protein localized to the nucleus and presynaptic nerve terminal［J］.Neurosci，1988，8(8):2804-2815.

［10］ Polymeropoulos M H，Higgins J J，Golbe L I，et al.Mapping of a gene for Parkinson's disease to chromosome 4q21-q23［J］.Science，1996，274(5290):1197-1199.

［11］Kruger R，Muller T，Riess O.Involvement of alpha-synuclein in Parkinson's disease and other neurodegenerative disorders［J］.Neural Transm，2000，107(1):31-40.

［12］ Alim M A，Ma Q L，Takeda K，et al.Demonstration of a role for alpha-synuclein as a functional microtubule-associated protein ［J］.J Alzheimers Dis，2004，6(4):435-442.

［13］ Guangwei L，Wang P，Xin L，et al.Alpha-synuclein promotes early neurite outgrowth in cultured primary neurons［J］.Neural Transm，2013，120(9):1331-1343.

［14］王鵬，許潔，李昕，等.突變型alpha-突觸核蛋白對大鼠原代培養(yǎng)神經(jīng)元突起生長作用研究［J］.首都醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2012，33(5)，629-633.

［15］李雁，殷娟娟，李昕，等.α-突觸核蛋白寡聚體對多巴胺能神經(jīng)細胞線粒體膜電位的影響［J］.中國現(xiàn)代神經(jīng)疾病雜志，2008(8):26-31.

［16］ Kohn J Y，Choi D W.Quantitative determination of glutamatemediated cortical neuronal injury in cell by lactate dehydrogenase efflux assay［J］.J Neurosci Methods，1987，20(1):83-90.

［17］Alim M A，Hossain M S，Arima K，et al.Tubulin seeds alpha-synuclein fibril formation［J］.J Biol Chem，2002，277(3):2112-2117.

［18］劉光偉，王鵬，李堯華，等.α-突觸核蛋白促進大鼠原代培養(yǎng)神經(jīng)元突起生長［J］.首都醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2009，30(5):607-610.

［19］尹娜，陳予東，李昕，等.帕金森病患者血漿增強α-突觸核蛋白寡聚體形成［J］.首都醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2013，34(6):840-843.

［20］李瑛，劉光偉，李昕，等.α-突觸核蛋白促進過氧化氫誘導(dǎo)的多巴胺能神經(jīng)細胞凋亡［J］.首都醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2011，32(6):771-776.

［21］ Sung J Y，Kim J，Paik S R.Induction of neuronal cell death by Rab5A-dependent endocytosis of alpha-synuclein［J］.Biol Chem，2001，276(29):27441-27448.

［22］ Chen L，Jin J，Davis J，et al.Oligomeric alpha-synuclein inhibits tubulin polymerization［J］.Biochem Biophys Res-Commun，2007，356(3):548-553.